提供了经济的包含许多可用于细胞增殖的因子的牛血清组合物的制备方法。其包括用抗凝剂进行牛全血的抗凝处理的步骤，从抗凝全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分的步骤，和在给定的温度下促进和激活所得白细胞和血小板之间的相互作用达不少于给定的时间以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，和用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理的步骤。
Bovine serum composition and method of culturing cells using the bovine serum composition as additive
The preparation method of bovine serum composition containing many factors that can be used for cell proliferation is provided. It includes the steps of anticoagulant treatment of whole blood with anticoagulants, the step of obtaining the white film layer from anticoagulant whole blood and the step of the proportion of specific gravity than the white film layer, and promoting and activating the interaction between leukocytes and platelets at a given temperature not less than a given time to cause from white cells and / or platelets. The process of secreting or releasing humoral factors and recoagulating the blood components containing humoral factors with a coagulant.
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】牛血清组合物和使用所述牛血清组合物作为添加剂培养细胞的方法[
]本专利技术涉及牛血清组合物和通过使用所述牛血清组合物作为添加剂培养细胞的方法。[
技术介绍
]已知向培养基中加入牛血清对于培养细胞的增殖是有效的。特别地，胎牛血清含有许多包括生长因子在内的体液因子，并已成为细胞培养的标准。然而，由于牛海绵状脑病(BSE)的问题，在大洋洲(除了发生BSE的那些国家之外的国家)生产的胎牛血清被广泛使用，因此导致价格飞涨。尽管不是来源于胎儿的成年牛血清也可以用于细胞培养，但已知成年牛血清不像胎牛血清那样含有那么多包括生长因子在内的体液因子。另一方面，据报道，加入富血小板血浆(PRP)的培养基可用于细胞的培养和增殖，所述富血小板血浆(PRP)通过在抗凝处理后对人全血进行离心等将血小板浓缩至高浓度制备(非专利文件1)。富血小板血浆含有大量的血小板衍生的转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生的生长因子-BB(PDGF-BB)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)、表皮生长因子(EGF)等，其诱导细胞增殖(非专利文件2)。除了上述生长因子之外，血小板还含有称为血小板因子4(PF4)的嗜中性粒细胞和单核细胞的趋化因子，并诱导白细胞的活化(非专利文件3)。除了血小板之外，全血中含有的血细胞组分还包含白细胞。白细胞分泌血小板活化因子(PAF)以及白细胞介素、干扰素和集落刺激因子，并且已知PAF活化血小板(非专利文件4)。通过静置、简单离心处理等方法从抗凝人全血中获得白膜层。就人而言，由于白膜层的比重与血浆和红细胞的比重明显不同，所以它是一种含有高浓度血小板以及高浓度白细胞的白色层。因此，其中白膜层内的血小板和白细胞相互活化并且大量包含各种体液因子包括由上述血小板和白细胞分泌的生长因子、趋化因子、活化因子等的血清被认为适用于细胞培养。然而，就牛而言，如下所述，红细胞的比重比人红细胞比重小，并且白细胞的比重和红细胞的比重部分重叠。结果，白膜层含有较少的白细胞并形成模糊层。因此，为了回收白细胞和血小板二者，还必须收获比重比白膜层比重大的级分(就牛而言=含有白细胞的级分)，如本专利技术所阐明的。近年来，已期望将细胞制剂作为再生医学产品的治疗应用。另一方面，已报道了静脉内施用例如通常不存在的细胞诱导血液凝固(非专利文件5)。因此，实现再生医学很重要的是建立不太可能诱导血液凝固的细胞培养方法。专利文件1描述了含有凝固脐带血的液体组分的增殖刺激剂。所述刺激剂促进间充质干细胞的增殖。在专利文件1中，向未凝固的脐带血中添加红细胞沉降剂，以将血液分离为含有红细胞的级分和上清液级分。将上清液级分分离成含有造血干细胞的沉淀级分和含有血小板的液体级分。然后，使含有血小板的液体级分与玻璃珠接触以产生增殖刺激剂。也就是说，增殖刺激剂不含有其中存在白细胞和造血干细胞的沉淀级分。另一方面，如下所述，本专利技术提供了血清组分，其通过下列方式获得：在给定温度下激活白膜层中白细胞和血小板的相互作用达不少于给定的时间，并进行包含所得体液组分的血液组分的再凝固处理。因此，本专利技术与专利文件1中描述的专利技术完全不同。专利文件2描述了一种通过从含有抗凝剂的血液中除去富血小板血浆和材料组分并将由玻璃材料组成的吸附部件供给到所得血浆中以通过吸附除去血浆中的纤维蛋白原从而分离血清的方法。在专利文件2中，利用纤维蛋白原附着于玻璃材料的表面，使用玻璃材料作为吸附材料以除去血浆中的纤维蛋白原。在本专利技术中，如下所述，加入玻璃材料以进一步激活白膜层中白细胞和血小板的相互作用。因此，本专利技术与专利文件2中描述的专利技术完全不同。在专利文件3中，通过下列方式获得浓缩血清：在凝固前离心收集的人血而不添加抗凝剂，从上清液中除去80％的血浆，将包含血小板的剩余血液组分充分悬浮并添加玻璃珠作为血液凝固促进材料以活化血小板，凝固血液并从前述血小板释放生长因子。另外，在专利文件4中，将抗凝剂添加到收集的人血中，将血液离心，除去上清液中的80％血浆，将包含血小板的剩余血液组分充分悬浮，添加氯化钙水溶液作为血液凝固促进材料以活化血小板并凝固血液，同时从前述血小板释放生长因子，从而获得浓缩血清。在本专利技术中，如下所述，在加入了抗凝剂的牛血中，通过下列方式获得血清组分：收集比重范围相对宽的级分(包含白膜层)和比重比白膜层比重大的级分(包含白细胞，就牛而言)，在给定的温度下激活白细胞和血小板的相互作用达不少于给定的时间，并且进行包含所得体液组分的血液组分的再凝固处理。因此，本专利技术与专利文件3和4中描述的专利技术完全不同。[文件列表][专利文件]专利文件1:JP-A-2011-160799专利文件2:JP-A-2006-104106专利文件3:JP-A-2014-118362专利文件4:JP-A-2014-117347[非专利文件]非专利文件1:TissueEngPartCMethods.2009Sep;15(3):431-5.非专利文件2:PlastReconstrSurg.2004;114:1502-1508.非专利文件3:ProcNatlAcadSciUSA.1981Jul;78(7):4584-7.非专利文件4:Nature.1974Jun7;249(457):581-2.非专利文件5:BiochemBiophysResCommun.2013Feb8;431(2):203-9。[专利技术概述][本专利技术要解决的问题]本专利技术提供了一种生产牛血清组合物的非常规方法，具体而言，本专利技术的目的在于提供一种经济的牛血清组合物的制备方法，所述牛血清组合物含有许多可用于细胞增殖的因子和许多抑制细胞凝固血液的因子。[解决问题的方式]本专利技术的牛血清组合物的制备方法独特地包括：用抗凝剂进行牛全血的抗凝处理的步骤，从抗凝牛全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分的步骤，以及在给定的温度下激活获得的白细胞和血小板之间的相互作用达不少于给定的时间以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，并用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理的步骤。[专利技术效果]通过本专利技术的牛血清组合物的制备方法获得的牛血清组合物是经济的并含有许多细胞生长因子。根据本专利技术，例如，可以从牛全血制备具有与胎牛血清相当或更高的增殖促进作用的血清组合物。胎牛血清通过杀死胎儿获得。因此，考虑到窗口期(其间通过进行测试无法确认感染的空白期)，不能在之后进行感染的血液测试。但是，例如，就在种牛中窗口期为3个月的感染而言，通过在血清组合物制造后3个月进行血液测试，可以完全排除感染，由此可以获得安全性高的血清组合物。因此，通过本专利技术获得的牛血清组合物在低成本，安全性和细胞生长增强方面等同于或高于胎牛血清。而且，它不容易诱导细胞凝固血液。通过本专利技术获得的牛血清组合物作为细胞培养用添加剂非常优异。[附图简述]图1显示了人的各血液组分的比重。图2显示了牛和人的抗凝全血的离心结果。图3显示了在各比重下牛抗凝全血的离心结果。图4显示了牛抗凝全血的连续离心的结果。图5显示了来源于人骨髓的间充质干细胞的细胞增殖曲线。图6显示了来源于人羊膜的间充质干细胞的细胞增殖曲线。[实施方案描述](血清组合物的制备方法)下面参照附图具体解释本专利技术的实施方案。该实施方案旨在便于理解本专利技术的原理。本专利技术的范围不限于以本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.牛血清组合物的制备方法，所述方法包括：用抗凝剂进行牛全血的抗凝处理的步骤，从抗凝牛全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分的步骤，和在给定的温度下促进和激活所得白细胞和血小板之间的相互作用达不少于给定的时间以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，并用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理的步骤。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.11.16 JP 2015-2240751.牛血清组合物的制备方法，所述方法包括：用抗凝剂进行牛全血的抗凝处理的步骤，从抗凝牛全血获得白膜层和比重比白膜层比重大的级分的步骤，和在给定的温度下促进和激活所得白细胞和血小板之间的相互作用达不少于给定的时间以引起从白细胞和/或血小板中分泌或释放体液因子，并用再凝固剂进行包含体液因子的血液组分的再凝固处理的步骤。2.根据权利要求1的制备方法，其中所述比重比白膜层比重大的级分是比重为1.071-1.084的级分。3.根据权利要求1或2的制备方法，其中所述给定的温度为环境温度至40℃并且时间为不少于5min。4.根据权利要求1-3中任一项的制备方法，其进一步包括通过加入玻璃材料激活白膜层。5.根据权利要求1-4中任一项的制备方法，其中所述抗凝剂为柠檬酸钠或柠檬酸。6.根据权利要求1-5中任一项的制备方法，其中所述再凝固剂为氯化钙溶液。7.根据权利要求1-6中任一项的制备方法，其中所述白膜层通过离心机或连续离心机获得。8.根据权利要求1-7中任一项的...
【专利技术属性】
技术研发人员：山原研一，须藤薰雄，须藤稔太，广岛友治，
申请(专利权)人：山原研一，
类型：发明
国别省市：日本,JP
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