一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法技术

本发明专利技术提供了一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，通过柠檬酸铁固体培养基分离、纯化厌氧活性污泥中的厌氧菌，并根据菌落周围培养基变黑范围的大小初步选定出一些高产电能力胞外产电菌，再通过循环伏安法对初步选定的高产电能力胞外产电菌进行测定和对比，最终筛选出最优高产电能力胞外产电菌，为后续的产电菌的诱导驯化奠定基础。该方法简单易行，可以高效准确的筛选出厌氧活性污泥中的高产电能力胞外产电菌。

A method for screening extracellular electricity producing bacteria with high electrical capacity in anaerobic activated sludge

The invention provides a method for screening extracellular electricity producing bacteria with high electric capacity in anaerobic activated sludge. According to the principle that Fe3+ can be reduced to Fe in iron citrate, the anaerobic bacteria in anaerobic activated sludge are isolated and purified by the iron citrate solid medium, and some high-yield extracellular producing bacteria are preliminarily selected according to the size of the dark range of the culture medium around the colony, and the preliminary selection by cyclic voltammetry is used. The determination and comparison of high-yield electric capacity extracellular producing bacteria, and finally screening out the optimal high-yield electric ability of extracellular producing bacteria, laying the foundation for the subsequent induction of acclimation of the producing bacteria. The method is simple and feasible, and can efficiently and accurately screen extracellular electricity producing bacteria with high production capacity in anaerobic activated sludge.

【技术实现步骤摘要】
一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法
本专利技术涉及胞外产电菌筛选领域，尤其涉及一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。
技术介绍
厌氧活性污泥是厌氧微生物群体及它们所依附的有机物质和无机物质的总称。厌氧活性污泥中包含丰富的厌氧微生物，适合筛选胞外产电菌。胞外产电菌具有直接将电子传递给化合物或间接电子受体的能力，多为厌氧菌或兼性厌氧菌。许多厌氧菌只能将电子传递给可溶性外源化合物，如硝酸盐或硫酸盐，它们能通过扩散作用进入细胞膜内部，胞外产电菌具有将电子传递到胞外的能力区别于其他厌氧微生物，这种能力可作用于微生物燃料电池产电。胞外产电菌在电池阳极氧化有机物产生电子，通过外电路传递到阴极，与阴极的氧气、质子发生还原反应生成水，完成整个氧化还原过程产生电流。在整个产电过程中胞外产电菌作为生物催化剂起到重要作用。筛选高产电能力胞外产电菌对研究单菌对微生物燃料电池的产电影响和其电子转移机制有着重要意义。目前仅两类模式异化金属还原菌被分离纯化出来和进行了系统的研究，对其它胞外产电菌的筛选尚无简单有效的方法，而筛选出高产电能力的产电菌是进行后续拓展研究的关键。专利CN201210059296公开了一种筛选产电微生物的方法，但此法筛选出的微生物并非全是产电菌，也不能很准确的筛选出产电能力较高的产电菌以便于后续的诱导驯化工作。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法。在厌氧条件下，富集厌氧活性污泥中的厌氧菌。将厌氧菌的菌液稀释并涂布在柠檬酸铁固体培养基上；根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，查看是否有使柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落，使柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落进行纯化得到纯菌株。对比各纯菌株使柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，变黑范围最大的初步选定为高产电能力胞外产电菌。通过循环伏安法测定并对比多个初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。本专利技术的技术方案如下：一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，包括步骤：S1：在LB液体培养基中富集厌氧活性污泥中的厌氧菌；S2：稀释厌氧菌的菌液并将菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上；S3：查看柠檬酸铁固体培养基上是否有使培养基由褐色变为黑色的单菌落，若无则重复步骤S1和S2，若有则通过平板划线法对使培养基由褐色变黑的单菌落进行纯化得到纯菌株；S4：重复步骤S3获得一个以上纯菌株，在同等条件下对比各纯菌株使柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，变黑范围最大的纯菌株初步选定为高产电能力胞外产电菌；S5：重复步骤S4获得一个以上初步选定的高产电能力胞外产电菌；S6：在同等条件下通过循环伏安法测定并对比各个初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。优选的，柠檬酸铁固体培养基的配方为：胰蛋白胨：10g/L酵母提取物：5g/L,氯化钠：10g/L柠檬酸铁：20mmol/L琼脂粉：18g/L用NaOH调节pH＝7±0.3优选的，步骤S1至S5均在厌氧工作站内的厌氧条件下进行，厌氧工作站内温度保持在30℃。优选的，循环伏安法为三电极循环伏安法，玻碳电极作为工作电极，钛电极为对电极，Ag/AgCl电极作为参比电极。优选的，步骤S6具体包括：S61：通过三电极循环伏安法对无菌LB液体培养基进行测定获得曲线1；S62：通过三电极循环伏安法对接种初步选定的高产电能力胞外产电菌进行测定获得曲线2；S63：对比曲线1和所述曲线2，获得初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰；S64：重复步骤S61、S62和S63获得多个初步选定的高产电能力胞外产电菌的还原峰，对比对比各还原峰，还原峰最高的为最优高产电能力胞外产电菌。与现有技术相比，本专利技术的有益效果：本方法提供的一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，通过柠檬酸铁固体培养基分离、纯化厌氧污泥中的厌氧菌，并根据菌落周围培养基变黑范围的大小初步选定若干高产电能力胞外产电菌，再通过循环伏安法对初步筛选出的高产电能力胞外产电菌逐一进行测定和对比，从而筛选出一批产电能力比较高的胞外产电菌，为后续的诱导驯化做好准备，该方法简单易行，可以高效准确筛选出厌氧活性污泥中的高产电能力胞外产电菌。附图说明图1为本专利技术实施例1中所述的一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法的流程示意图；图2为本专利技术实施例1中所述的一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法的一次三电极系统对菌液和空白培养基进行CV扫描的实验结果图；具体实施方式：下面参照附图对本专利技术做进一步描述。实施例1如图1所示，一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，S1：在生活污水处理厂取厌氧活性污泥于灭菌后的PE管中,存放在4℃的冰箱中,待用。配制200ml常规LB液体培养基，通氮气15分钟，除去培养基内氧气。在厌氧工作站内取0.2g活性污泥加入LB液体培养基中，放置在厌氧工作站内的摇床上进行厌氧培养。摇床转数190rpm，培养温度30℃，培养时间48h。培养结束后，LB液体培养基由澄清变浑浊。S2：在厌氧工作站内对菌液进行梯度稀释，稀释为10-4、10-5、10-6梯度，将三个稀释梯度的菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上，每个梯度涂布两个平板。将三个稀释梯度的平板放于厌氧培养箱能培养48h，温度30℃。S3：在培养后的柠檬酸铁固体培养基上寻找使培养基变为黑色的单菌落，若无则重复上述步骤S1和S2，若有则将变黑范围比较大的单菌落用接种环挑出，使用平板划线法进行纯化。划线3-4代后，得到其中纯菌株，并命名为B-1菌株，使用革兰氏染色法对B-1菌株进行染色，显微镜下观察为革兰氏阴性菌。整个操作过程在厌氧工作站内进行。S4：待获得多个纯菌株后，对比各个纯菌株使培养基变黑范围的大小，变黑范围最大者为初步选定的高产电能力胞外产电菌。S5：重复步骤S4以获得更多的初步选定的高产电能力胞外产电菌。S6：将菌株B-1接种在LB液体培养基内，同时制作空白灭菌后LB液体培养基。将2份液体培养基放入厌氧培养箱内培养48小时后。使用三电极系统进行CV扫描，如图2所示，菌液CV中在0.9V的位置出现了明显的氧化峰，空白培养基则无明显氧化还原峰。S7：继续在同等条件下测定初步选定的高产电能力胞外产电菌，并对比各个初步选定的高产电能力胞外产电菌的氧化峰，进而选出一批产电能力相对较高的胞外产电菌，为后续的诱导驯化工作做好基础工作。本方法提供的一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，根据胞外产电菌可将柠檬酸铁中Fe3+还原成Fe这一原理，通过柠檬酸铁固体培养基分离、纯化厌氧活性污泥中的厌氧菌，根据菌落周围培养基变黑范围的大小初步选定高产电能力胞外产电菌并通过循环伏安法对初步筛选出的高产电能力胞外产电菌进行进一步的对比筛选，从而最终筛选出最优高产电能力胞外产电菌，以便做进一步研究，该方法简单易行，可以高效准确的筛选出厌氧活性污泥中的高产电能力胞外产电菌。应当理解的是，本专利技术的应用不限于上述的举例，对本领域正常技术人员来说本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，包括步骤：S1：在LB液体培养基中富集厌氧活性污泥中的厌氧菌；S2：稀释所述厌氧菌的菌液并将所述菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上；S3：查看所述柠檬酸铁固体培养基上是否有使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落，若无则重复所述步骤S1和S2，若有则通过平板划线法对使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落进行纯化得到纯菌株；S4：重复所述步骤S3获得一个以上所述纯菌株，在同等条件下对比各所述纯菌株使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围最大的所述纯菌株为初步选定的高产电能力胞外产电菌；S5：重复所述步骤S4获得一个以上所述初步选定的高产电能力胞外产电菌，S6：在同等条件下通过循环伏安法测定所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，对比所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，所述电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。

【技术特征摘要】
1.一种在厌氧活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，包括步骤：S1：在LB液体培养基中富集厌氧活性污泥中的厌氧菌；S2：稀释所述厌氧菌的菌液并将所述菌液涂布于柠檬酸铁固体培养基上；S3：查看所述柠檬酸铁固体培养基上是否有使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落，若无则重复所述步骤S1和S2，若有则通过平板划线法对使所述柠檬酸铁固体培养基由褐色变为黑色的单菌落进行纯化得到纯菌株；S4：重复所述步骤S3获得一个以上所述纯菌株，在同等条件下对比各所述纯菌株使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围的大小，使所述柠檬酸铁固体培养基变黑范围最大的所述纯菌株为初步选定的高产电能力胞外产电菌；S5：重复所述步骤S4获得一个以上所述初步选定的高产电能力胞外产电菌，S6：在同等条件下通过循环伏安法测定所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，对比所述初步选定的高产电能力胞外产电菌的电化学活性，所述电化学活性最高的菌株为最优高产电能力胞外产电菌。2.根据权利要求1所述的一种在活性污泥中筛选高产电能力胞外产电菌的方法，其特征在于，所述柠檬酸铁固体培养基的配方为：胰蛋白胨：10g/L酵母提取物：5g/L,氯化钠：10g/L柠檬酸铁：20mmol/L...

【专利技术属性】
技术研发人员：温洪宇，王国振，王梦影，
申请(专利权)人：江苏师范大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32