一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法技术

本发明专利技术公开了一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。本发明专利技术一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的方法。本发明专利技术试剂盒可以准确预测青稞品种的籽粒蛋白含量，为农业生产有重要的指导作用。

【技术实现步骤摘要】
一种检测青稞籽粒蛋白的试剂盒和方法
本专利技术涉及青稞的质量检测，具体涉及青稞籽粒蛋白的检测试剂盒和方法。
技术介绍
青稞，即六棱裸大麦(HordeumvalgareL.var.nudumHook.f.)，属于禾本科大麦属(Hordeumvulgare)作物。大麦具有丰富的营养价值和经济价值，六棱裸大麦主要用来食用和而二棱皮大麦则主要用于啤酒酿造业。大麦作为动物的饲料是牲畜的主要蛋白来源，大麦作为人类的食物使用量很少，青藏高原地区是世界上最大的以六棱裸大麦(青稞)为人类口粮的地区。大麦籽粒蛋白质含量与大麦品质之间有复杂的交互作用(Foxetal.,2003)。籽粒蛋白质含量是决定谷物品质的重要因素，高籽粒蛋白质含量的大麦(12％以上)由于对品质有较好的影响和较高的营养价值，通常被用作饲料和食用，而低籽粒蛋白质含量的大麦(11.5％以下)通常被用于啤酒酿造(Distelfeldetal.,2008)或饼干等。籽粒蛋白质含量是衡量谷类作物品质的重要指标，其含量受包括基因型和环境因素在内的多重因素的影响(Jukanti&Fischer,2008；Smith,1990；Blancoetal.,2012；Bogardetal.,2010)。传统的育种过程在籽粒蛋白质含量品质改良方面进展很慢，因为籽粒蛋白质含量受复杂的基因调控的影响(Simmonds,1995)。因此，通过基因手段提前检测青稞品种的籽粒蛋白有非常重要的实际意义。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供了一种检测青稞籽粒蛋白含量的方法。本专利技术检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。优选地，它包括检测HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A的试剂。优选地，它还包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点处变异的试剂。优选地，它包括检测HvNAM1基因上第+54bp为G、+544bp为C、+563bp为A和+1004bp为G的试剂。优选地，所述试剂为测序用试剂、Snapshot试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。优选地，所述试剂还包括扩增HvNAM1基因全长序列并检测第+54bp、第+234bp、+544bp、+563bp、+1004bp和+1433bp位点的试剂。本专利技术还提供了检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂在制备检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂中的用途。本专利技术还提供了一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的方法，其特征在于：步骤如下：1)检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处的碱基；2)根据步骤1)的结果预测青稞低籽粒蛋白质含量。步骤1)中，还同时检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点的碱基。步骤1)中，所述检测基因的碱基的方法是测序、Snapshot、限制性片段长度多态性方法或者单链构象多态性分析方法。步骤2)中，若HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A，则青稞低籽粒蛋白质含量低。本专利技术的关键在于发现了青稞HvNAM1基因上的SNP位点与青稞的籽粒蛋白相关，通过测序或者其他现有常规方法确定青稞品种的HvNAM1基因上的第+234bp和+1433bp位点处的碱基，或者还可以进一步第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点的碱基，就可以准确预测青稞品种的籽粒蛋白的含量，如，若检测多青稞品种的HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A，则其栽种得到的青稞低籽粒蛋白质较低，营养价值低，可以选择不栽种此类青稞。本专利技术方法检测方法简单，通过测序即可确定青稞籽粒蛋白含量，不需要栽种后选取大规模的样品进行检测，操作简便。本专利技术首次阐明了青稞HvNAM1基因上的位点多态性与籽粒蛋白的相关性。使用本专利技术提供的试剂盒，可以预测青稞品种的籽粒蛋白含量，为农业生产有重要的指导作用。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。具体实施方式实施例1本专利技术青稞HvNAM1基因单倍型Hap3与青稞籽粒蛋白含量的相关性一、实验方法1、实验材料参试材料共计302份。从地理来源上覆盖了青藏高原及其毗邻的青稞各大种植区(西藏、青海、甘肃、云南、贵州、四川)，另外还包含部分青藏高原以外的外引大麦栽培品种。从材料类型上划分，包含青藏高原野生大麦品种185份，青稞地方品种73份，青稞育成品种(系)30份，外引大麦栽培品种14份(参试材料详细信息见附表1)。所有参试材料于2013年和2014年在青海省湟中县大源乡地窑村(N36°28'29.36”，E101°31'9.15”，海拔2700m)进行种植，每份材料种植两行，行长2m，行距20cm，每行种植40粒种子，三次重复，生育期内采取相同的田间管理措施。2、籽粒蛋白质含量测定按不同材料收获后的种子，经过充分的自然干燥直到达到恒定的质量(多次称重间质量差异<0.01g)，取适量种子粉碎，用近红外谷物分析仪(型号：DA7250，Perten，Sweden)测定蛋白含量。取三次重复的平均值作为该材料的籽粒蛋白质含量。3、青稞HvNAM1基因单倍型的测定(1)参试材料DNA提取采用改进的CTAB法(StewartJr&Via,1993)提取参试材料基因组DNA，每份材料取5粒种子种于培养皿中，至3叶-4叶期取新鲜叶片进行DNA的提取，详细步骤如下：(1)取幼嫩植株叶片置于研钵，液氮冷冻研磨至粉末，转移至2mlEP管中(粉末的量大约为EP管的1/4-1/3)；(2)EP管中加入980μL65℃预热的2×CTAB缓冲液及20μLβ-巯基乙醇，充分混匀；(3)EP管置于水浴锅65℃水浴60min(根据情况可适当调整)；每隔15min轻轻混匀一下；(4)水浴结束后，取出EP管，10,000rpm离心10min；(5)将上清液转移至2ml干净EP管中(大约1000ul)。加入500μLTris-饱和酚与500ul氯仿，充分混匀，轻摇20min。静置至分层，10,000rpm，离心15min；(6)取上清于另一干净1.5mlEP管中，加入等体积的氯仿，混匀，轻摇10min。静置至分层，10,000rpm，离心10min；(7)取上清，加入等体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀。-20℃下放置30min；(8)10,000rpm，离心10min。倒掉上清，留沉淀；(9)70％乙醇清洗沉淀两遍，无水乙醇洗一遍；(10)沉淀自然晾干，加入200μLddH2O溶解沉淀；(11)至沉淀充分溶解，加入适量RnaseA，37℃水浴中降解1h；(12)加入300μL水，补充体积至500μL；(13)重复步骤5、6；(14)加入10％体积的5M醋酸钠，2倍体积的预冷无水乙醇，混匀至出现絮状沉淀。15-20℃下放置30min，10,000rpm，离心10min。倒掉上清，留沉淀；(15)重复步骤9；(16)本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。

【技术特征摘要】
1.一种检测青稞低籽粒蛋白质含量的试剂盒，其特征在于：它包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+234bp和+1433bp位点处变异的试剂。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：它包括检测HvNAM1基因上第+234bp为C和+1433bp为A的试剂。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：它还包括任选的用于检测HvNAM1基因上第+54bp、+544bp、+563bp和+1004bp位点处变异的试剂。4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：它包括检测HvNAM1基因上第+54bp为G、+544bp为C、+563bp为A和+1004bp为G的试剂。5.根据权利要求1～4任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂为测序用试剂、Snapshot试剂、限制性片段长度多态性方法用试剂或者单链构象多态性分析用试剂。6.根据权利要求1～5任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂还包括扩增HvNAM1基因全...

【专利技术属性】
技术研发人员：王蕾，沈裕虎，王寒冬，毛成志，孔豆豆，
申请(专利权)人：中国科学院西北高原生物研究所，
类型：发明
国别省市：青海,63