一种人3型腺病毒衣壳蛋白同时展示CA16双中和抗原表位疫苗候选株的制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及重组病毒基因工程技术领域，具体涉及一种人3型腺病毒衣壳蛋白同时展示CA16双中和抗原表位疫苗候选株的制备方法和应用，在人3型腺病毒六邻体上的两个高变区同时插入CA16的中和表位。该疫苗候选可以提高CA16中和抗原表位的抗原性，诱导抗CA16感染的免疫反应，利用该疫苗候选株可以制备预防CA16感染的重组表位疫苗。

【技术实现步骤摘要】
一种人3型腺病毒衣壳蛋白同时展示CA16双中和抗原表位疫苗候选株的制备方法和应用
本专利技术涉及重组病毒基因工程
，具体涉及一种人3型腺病毒衣壳蛋白同时展示CA16双中和抗原表位疫苗候选株的制备方法和应用。
技术介绍
手足口病是由肠道病毒引起的急性传染病，该病主要感染5岁以下婴幼儿，可引发手、足、口腔等部位的疱疹，少数患儿可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑膜脑炎等并发症。柯萨奇A16型与肠道病毒71型是引起手足口病的常见病原。CA16与EV71呈交替流行或者同时在一个地区内流行。在以往的研究中，大多数手足口的致死病例是由EV71感染引起的，所以人们对EV71的研究比较多。但通过对近些年的手足口病原的检测及报道，CVA16感染也可能导致严重的手足口病，像无菌性脑膜炎，心肌炎，肺部综合征，严重甚至发生致死性心肌炎和肺炎。此外，EV71和CA16的混合感染会加重患者病情，使手足口病更加难以控制。疫苗的使用可以有效的控制病毒传播。目前，预防EV71的疫苗已经上市，由于EV71疫苗的使用，在一定程度上使得的重症手足口病的发生率有所下降。但目前由CVA16感染引起的重症手足口病还没有商品化的疫苗投入使用，这使得人们对重症手足口病的预防还没有得到完全控制，婴幼儿仍然会因手足口病而发生相应的重症。如果预防CVA16的疫苗在市面上大量使用，那么势必会更加降低手足口病的重症情况。然而，相比于EV71，CVA16的基因功能尚未完全明确，无法确定其病毒毒性基因，因此目前市面上还没有有效的CVA16减毒疫苗株，并且减毒活疫苗可能毒力返强，存在一定安全问题。随着分子生物学的研究进展，人们对病毒结构的不断解析，利用重组技术研究亚单位疫苗可以有效的提高疫苗的安全性。CVA16为正链小RNA病毒，病毒颗粒的空间结构为二十面体，由内部核酸以及衣壳构成，无囊膜结构，其开放阅读框P1区编码结构蛋白，分为VP1，VP2，VP3，VP4四个部分。CVA16VP1上集中了主要抗原决定簇。目前已经研制CVA16病毒样颗粒(VLP)，并且在小鼠中进行实验，结果表明CVA16VLP亚单位疫苗可以诱导出较强的免疫反应[17]。但由于VLPs产量较低，生产成本高，且在规模生产时，易导致产品结构和组分不相容，限制了其在疫苗研究中的发展。表位疫苗是近年来发展起来的一种新型疫苗，相对传统疫苗，拥有较多优势。病毒抗原片段上的中和抗原表位可以直接刺激机体产生中和抗体。目前已经研究众多的合成肽疫苗预防不同疾病[19-21]。CVA16的中和抗原表位主要为其结构蛋白VP1上，其中和抗原表位可以刺激机体产生中和抗体。虽然合成肽疫苗具有许多优点，但其仍存在许多问题。合成肽的免疫原性较低，抗原表位的筛选技术不成熟，免疫时需要使用免疫佐剂，病原微生物的中和表位多为构像表位，这些难题阻碍合成肽疫苗的发展。腺病毒载体高表达，使用其作为疫苗载体无需添加佐剂，可通过肌肉或粘膜方式免疫，免疫后的机体可以同时诱导B细胞与T细胞免疫反应，易于生产制备。因此，腺病毒载体被广泛应用于各种预防性和治疗性疫苗的研发。腺病毒六邻体的高变区可以被外源氨基酸替换，作为嵌合疫苗载体，从而使机体直接针对所递呈的片段而产生抗体。随着人们对腺病毒蛋白功能的不断研究，目前已发现众多型别腺病毒可以作为嵌合疫苗载体。人3型腺病毒作为B组腺病毒的一种，其与CA16具有相同的受体。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种人3型腺病毒衣壳蛋白同时展示CA16双中和抗原表位疫苗候选株的制备方法和应用。本专利技术提供了一种重组人3型腺病毒，人3型腺病毒六邻体的HVR1、HVR2区上同时插入CA16的SP55的中和表位抗原表位，所述CA16中和表位SP55的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。优选的，所述CA16中和表位SP55的替换区为HAdv3六邻体的HVR1和HVR2区。更为优选的，所述CA16SP55中和表位替换氨基酸序列为Ad3六邻体的HVR1区的AGEER及HVR2区的TTEGEE。本专利技术还提供了一种人3型腺病毒-CA16的双中和表位疫苗候选株，所述双中和表位苗候选株含有权利要求1-3任一项所述的重组人3型腺病毒。本专利技术还提供了一种载体，所述载体包含上述所述的重组人3型腺病毒。本专利技术还提供了一种重组人3型腺病毒的制备方法，包括如下步骤：在人3型腺病毒的六邻体上的HVR1区及HVR2区同时嵌入CA16中和表位SP55；其中，所述CA16中和表位SP55的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。所述CA16中和表位SP55所替换氨基酸为Ad3六邻体的HVR1区的AGEER及HVR2区的TTEGEE。本专利技术所提供的重组腺病毒，允许CA16中和表位个别氨基酸的缺失、替换或添加。但需要保持中和表位的免疫原性；允许被置换的HVR1及HVR2区个别氨基酸的缺失、替换或添加，但需要保持腺病毒的稳定性，同时保证外源表位的免疫活性；本专利技术中嵌入的CA16表位不限于SP55，也可以是其他的保护性T细胞表位或B细胞表位，但需要保持腺病毒的稳定性和保证外源表位的免疫原性。本专利技术的有益效果在于：本本专利技术中，在六邻体衣壳上同时展示CA16中和表位，该重组腺病毒可以产生抗CA16感染的免疫应答，多次免疫注射能加强免疫，还可以预防CA16感染。本专利技术通过采用人3型腺病毒的衣壳展示CVA16的中和抗原表位，将CA16的SP55的中和表位抗原表位同时插入到人3型腺病毒六邻体的HVR1、HVR2区，构建同时展示CVA16相同表位的嵌合病毒，为预防CVA16感染奠定基础，为更好的防治重症手足口病提供借鉴工具。附图说明图1是抗AdSP55R1R2△E3GFP血清对CA16感染VERO细胞图片；其中，(A)为AdSP55R1R2△E3GFP免疫血清32倍稀释后与100TCID50的CA1637℃混合孵育后接种VERO后的细胞图片；(B)为100TCID50的CA1637℃混合孵育后接种VERO72h后的细胞图片。具体实施方式为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图1对本专利技术作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本专利技术的限定。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1：构建重组病毒载体以HAdV3载体为模版，重叠PCR扩增含有CA16病毒主要中和抗原表位的六邻体片段，将CA16的中和抗原表位替换腺病毒六邻体上HVR1区的氨基酸序列。经过ClaI，BamHI双酶切后与经过ClaI，BamHI酶切后的穿梭质粒PBRLOR连接构建穿梭质粒，命名为PBRLOR-CA16HVR1。在按照相同的方法，将同样氨基酸序列的CA16中和抗原表位替换HVR2区的氨基酸，构建PBRLOR-CA16HVR1-HVR2。将构建好的穿梭质粒经过EcoRI，SalI双酶切与骨架质粒pBRAd3△E3GFP经过PacI，AvRII在BJ5183内同源重组，得到重组质粒pAdSP55HVR1-HVR2△E3GFP。所使用的引物见表1，CA16r1，CA16r2为PCR筛选鉴定用特异引物。表1重叠PCR法扩增外源表位嵌入的HAdv3六邻体基因使用的引物将本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种重组人3型腺病毒，其特征在于：人3型腺病毒六邻体的HVR1、HVR2区上同时插入CA16的SP55的中和表位抗原表位，所述CA16中和表位SP55的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。

【技术特征摘要】
1.一种重组人3型腺病毒，其特征在于：人3型腺病毒六邻体的HVR1、HVR2区上同时插入CA16的SP55的中和表位抗原表位，所述CA16中和表位SP55的氨基酸序列为PKPTSRDSFAWQTAT。2.根据权利要求1所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述CA16中和表位SP55的替换区为HAdv3六邻体的HVR1和HVR2区。3.根据权利要求1所述的一种重组人3型腺病毒，其特征在于：所述CA16SP55中和表位替换氨基酸序列为Ad3六邻体的HVR1区的AGEER及HVR2区的TTEGEE。4.一种人3型腺病毒-CA16的双中...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟柏茂，蒋再学，陆小梅，刘玉玲，林子添，
申请(专利权)人：东莞市第八人民医院，东莞市儿科研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44