一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用，利用已建立的新城疫病毒PHY.LMV42株的反向遗传操作平台，将新型鸭细小病毒的VP3基因ORF插入NDV全长转录载体pLMV‑RFP，构建出重组质粒pLMV‑NDPV‑VP3，该重组质粒与三个辅助质粒共转染BHK‑21细胞后，获得了具有较高繁殖性能的表达NDPV‑VP3蛋白的重组疫苗株rLMV‑NDPV‑VP3。NDPV‑VP3基因位于新城疫病毒P基因和M基因之间非编码区，经反向遗传技术获得重组病毒rLMV‑NDPV‑VP3。该表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒可用于新型鸭细小病毒病和鸭新城疫的预防。

Recombinant Newcastle disease virus expressing new VP3 gene of Duck Parvovirus and its application

The invention provides a recombinant Newcastle disease virus expressing the VP3 gene of the New Duck Parvovirus and its application. Using the reverse genetic operation platform of the established Newcastle disease virus PHY.LMV42 strain, the VP3 gene ORF of the New Duck Parvovirus is inserted into the NDV full length transcriptional carrier pLMV RFP, and the recombinant plasmid pLMV NDPV NDPV VP3 is constructed. After CO transfection of the recombinant plasmid and three auxiliary plasmids to BHK 21 cells, the recombinant vaccine strain rLMV NDPV VP3, a recombinant vaccine strain with high reproductive performance, was obtained for the expression of VP3 protein. The NDPV VP3 gene is located in the non coding region between the P gene and M gene of Newcastle disease virus, and the recombinant virus rLMV NDPV NDPV VP3 is obtained by reverse genetics. The recombinant Newcastle disease virus expressing the VP3 gene of New Duck Parvovirus can be used for the prevention of New Duck Parvovirus Disease and duck Newcastle disease.

【技术实现步骤摘要】
一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用
本专利技术涉及反向遗传学应用领域，具体涉及一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒及其应用。
技术介绍
2014年以来，在我国山东、安徽、江苏等地鸭群中大面积爆发了一种以生长迟缓、鸭(上下)喙变短、舌头外露下垂、跛行、瘫痪、拉稀以及翅、腿易折断为主要临床特征的传染性疾病，俗称“鸭短喙-侏儒综合征”或“鸭大舌病”。经鉴定该病病原为一种新型鸭细小病毒(novelduckparvovirus，NDPV)，与小鹅瘟病毒亲源关系较近，但二者不处于同一进化分支。鸭短喙-侏儒综合征主要发生于10-25日龄肉鸭，发病鸭常因采食和饮水困难而消瘦，甚至死亡，发病率20％-30％，甚至高达50％，给养鸭业造成了巨大的经济损失。因此，迫切需要开发相关疫苗用于该病的防控。新城疫(NewcastleDisease，ND)是危害养禽业的重要传染病之一，近年来，新城疫对鸭的危害日趋严重。疫苗接种和严格的生物安全措施是控制新城疫的主要措施。新城疫病毒在靶器官中定向增殖，分为嗜呼吸道毒株和嗜消化道毒株，嗜呼吸道毒株主要有Mukteswar株、HB1株、F本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：1)取鸭细小病毒，利用RT‑PCR方法扩增得到NDPV‑VP3基因，回收PCR产物，连接至pMD18‑T‑Vector；2)将NDPV‑VP3基因与pLMV‑RFP线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组NDV病毒质粒；3)将表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7‑3以MOI＝3的滴度接种于单层BHK‑21细胞的24孔板内，孵育1h后，将pLMV‑VP3、pcDNA‑NP、pcDNA‑P及pcDNA‑L质粒共转染BHK‑21细胞，转染72h后，将收获拯救的重...

【技术特征摘要】
1.一种表达新型鸭细小病毒VP3基因的重组新城疫病毒，其特征在于该重组新城疫病毒是通过以下方法构建的：1)取鸭细小病毒，利用RT-PCR方法扩增得到NDPV-VP3基因，回收PCR产物，连接至pMD18-T-Vector；2)将NDPV-VP3基因与pLMV-RFP线性化载体相连接，并将连接产物转化至Stbl2感受态细胞，筛选出阳性克隆，即得到重组NDV病毒质粒；3)将表达T7聚合酶的重组痘病毒vTF7-3以MOI＝3的滴度接种于单层BHK-21细胞的24孔板内，孵育1h后，将pLMV-VP3、pcDNA-NP、pcDNA-P及pcDNA-L质粒共转染BHK-21细胞，转染72h后，将收获拯救的重组病毒接种10日龄SPF鸡胚，收获HA、HI检测均为阳性的鸡胚尿囊液，即得到重组新城疫病毒rLMV-NDPV-VP3。2.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤1)中RT-PCR扩增的引物序列分别如SEQIDNo.4、SEQIDNo.5所示。3.根据权利要求1所述的重组新城疫病毒，其特征在于步骤2)中所述将NDPV-VP3基因与pLMV-RFP线性化载体相连接，具体包括以下操作：A)以含有PHY.LMV42全长cDNA的重组质粒pLMV-RFP为模板，利用引物在质粒pLMV-RFP的RFPORF的两端通过反向...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑文卿，李亚杰，杨保收，付旭彬，梁武，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12