一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法，该方法优化了发酵培养基，并通过对保护剂的大量筛选，在合适的条件下进行一级、二级发酵，再以二级种子液接种到麸皮固体培养基中，控制其在合适条件下进行高密度的发酵，发酵后进行分段式干燥，最后制备得到高活性粪肠球菌微生物制剂干粉，每克微生物制剂干粉含130～180亿个活菌。本发明专利技术有利地解决了现有冷冻干燥技术中生产设备投入大、能耗高、生产成本高的问题；同时解决了纯液态发酵方式活菌数低，运输成本高，添加不方便，保质期短的问题。

Preparation method of a highly active dry powder for Enterococcus faecalis microorganism preparation

The invention discloses a preparation method of high active microbial agent of Enterococcus faecalis, which optimizes the fermentation medium. Through a large number of screening of protectant, it is fermented at the first and two stages under suitable conditions, and then inoculated into the solid culture medium of bran with two grade seed liquid to control it under suitable conditions. With high density fermentation and subsection drying after fermentation, the dry powder of high active Enterococcus faecalis microbial preparation was prepared, and the dry powder contained 130~180 billion living bacteria per gram of microbial preparation. The invention effectively solves the problems of large production equipment, high energy consumption and high production cost in the existing freeze drying technology, and at the same time, it solves the problems of low living bacteria number, high transportation cost, inconvenient addition and short shelf life in pure liquid fermentation.

【技术实现步骤摘要】
一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法
本专利技术涉及微生物发酵
，具体涉及一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法。
技术介绍
粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是我国农业部允许的作为微生物饲料添加剂的菌种之一，被越来越多地科研机构研制成饲用微生物制剂。粪肠球菌能产生天然抗生素，有利于机体健康；同时产生细菌素等抑菌物质，抑制大肠杆菌和沙门氏菌等病原菌的生长，改善肠道微环境；还能抑制肠道内产尿素酶细菌和腐败菌的繁殖，减少肠道尿素酶和内毒素的含量，使血液中氨和内毒素的含量下降，同时在动物肠道内可形成生物薄膜附着于动物肠道粘膜上，并且发育、生长和繁殖。粪肠球菌能够将饲料中的纤维变软，提高饲料的转化率！因此在饲料中添加高活性粪肠球菌是一个绿色、安全、健康的选择。当前粪肠球菌制备技术，多采用传统低温冷冻干燥技术，该工艺生产设备投入大，液态发酵浓缩冻干过程中能耗高，生产成本高，不利于该产品大规模使用；或是纯液态发酵，市场只能使用水剂，但水剂活菌数低，运输成本高，添加不方便，同时保质期短。
技术实现思路
本专利技术公开了一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法，用以解决现有技术中存在的设备投入大、生产成本高、活菌数量低、添加不方便、保质期短的问题。为了解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法，包括以下步骤：(1)将活化的粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)斜面菌种转入无菌水中，形成种子液，所述种子液的浓度为5.0×108cfu/ml～1.0×109cfu/ml；(2)将步骤(1)得到的种子液以4％～6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/Vmin，罐压0.02～0.03Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到12～16小时时，添加保护剂1，发酵时间为16～20小时，使PH值降至3.6～4.2制成一级种子液，所述一级种子液的浓度为1.3×109cfu/ml～1.6×109cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的一级种子液以6～10％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/V·min，罐压0.04～0.05Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到14～18小时时，添加保护剂2，发酵时间18～24小时，使PH降至3.6～4.2值，制成二级种子液，所述二级种子液的浓度为1.8×109cfu/ml～2.4×109cfu/ml；(4)在无菌环境中，将步骤(3)得到的二级种子液添加保护剂3后，以8～10％的接种量接入灭菌后的麸皮固体培养基中，混合均匀，装袋进培养房培养；培养房培养期间，控制通风量为：3～10换气次数/天，温度34～38℃，湿度80％～90％，培养24～28小时，培养期间翻动麸皮固体培养基1～2次，由此制备得到含水分的粪肠球菌微生物制剂，所述含水分的粪肠球菌微生物制剂的含水量为35～40％，有效活菌数为1.5×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g；(5)将步骤(4)得到的含水分的粪肠球菌微生物制剂移入热风循环干燥烘箱，先46～48℃条件下处理1.5～2.0小时，然后在温度40～43℃烘干，制备得到高活性粪肠球菌微生物制剂干粉，所述高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的含水量为8～10％，有效活菌数为1.3×1010cfu/g～1.8×1010cfu/g。进一步地，步骤(2)中所述的一级发酵培养基的原料和制备方法为：每升含有西红柿汁160～175mL、胰蛋白胨5.0～8.0g、牛肉膏5.3～6.5g、酵母膏3.3～5.0g、柠檬酸氢二铵1.4～2.5g、蔗糖16.8～19.5g、吐温800.7～1.0mL、三水乙酸钠4.3～5.5g、三水磷酸氢二钾1.3～2.5g、七水硫酸镁0.28～0.48g、一水硫酸锰0.16～0.24g；将上述各原料混合均匀，调节PH为6.2～6.8，即得一级发酵培养基。进一步地，步骤(3)中所述的二级发酵培养基的原料和制备方法为：每升含有西红柿汁120～140mL、酪蛋白胨4.0～6.0g、牛肉膏粉5.3～6.5g、酵母粉3.3～5.0g、玉米淀粉35～45g、无水乙酸钠1.4～2.5g、柠檬酸钠3.3～5.0g、葡聚糖60～65g、乳糖8.5～10.0g、硫酸锰0.16～0.24g、柠檬酸钠4.3～5.5g、无水硫酸镁0.28～0.48g；将上述各原料混合均匀，调节PH为6.5～7.0，即得二级发酵培养基。进一步地，步骤(4)中所述的麸皮固体培养基原料和制备方法为：按质量分数计由以下组分组成：麸皮43％～55％、硫酸铵0.1％～0.5％、七水硫酸镁0.58～0.62％、一水硫酸锰0.32～0.38％，余量为水；将上述各原料混合均匀，在115～121℃条件下，灭菌40～45分钟，即得麸皮固体培养基。进一步地，所述保护剂1为海藻糖，添加量为7～10％。进一步地，所述保护剂2为可溶性淀粉，添加量为5.5～7.5％。进一步地，所述保护剂3为脱脂奶粉，添加量为12～15％。与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：本专利技术的高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法在一级发酵培养基中添加西红柿汁、蔗糖，并在菌液培养到12～16小时时，添加前期保护剂1海藻糖；二级发酵培养基中添加西红柿汁、玉米淀粉、葡聚糖，并培养到14～18小时时，添加前期保护剂2可溶性淀粉；将步骤(3)得到的二级种子液添加保护剂3脱脂奶粉。采用三级发酵方式，优化了发酵培养基，并对保护剂做了大量的前期筛选，特别是西红柿汁和蔗糖与保护剂1之间的搭配，西红柿汁、玉米淀粉、葡聚糖与保护剂2之间的搭配，以及保护剂1、保护剂2与保护剂3之间的搭配，并在合适的条件下进行一级、二级发酵，再以二级种子液接种到麸皮固体培养基中，控制其在合适条件下进行高密度的发酵，发酵后采用分段式干燥方式，有利地解决了现有冷冻干燥中生产设备投入大、能耗高、生产成本高的问题；同时解决了纯液态发酵方式活菌数低，运输成本高，添加不方便，保质期短的问题。经检测，按照本专利技术方法制备得到的高活性粪肠球菌微生物制剂干粉，每克微生物制剂干粉含130～180亿个活菌。附图说明图1为粪肠球菌菌落总数检验程序图。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术作进一步地阐述，但本专利技术不局限于这些实施例。实施例1在超净工作台中，将粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)冻干管菌种按照无菌操作要求打开，向冻干管中加入足量的无菌水，用无菌接种环将其混匀后，挑一环菌悬液接种在MRS琼脂试管培养基斜面上，将其放入生化培养，37±1℃培养20小时，再将试管斜面种子转接到MRS琼脂茄形瓶斜面培养基中，37℃培养18小时，然后用适量的无菌水将茄形瓶上成熟菌泥刮洗下来，装入250ml三角瓶，振荡均匀，形成种子液，其浓度为1.0×109cfu/ml。上述MRS琼脂培养基的原料和制备方法为：每升含有蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母膏5.0g、柠檬酸氢二铵[(NH4)2HC6H5O7]2.0g、葡萄糖(C6H12O6·H2O)20.0g、吐温801.0mL、乙酸钠(CH3COONa·3H2O)5.0g、磷酸氢二钾(K本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将活化的粪肠球菌斜面菌种转入无菌水中，形成种子液，所述种子液的浓度为5.0×108cfu/ml～1.0×109cfu/ml；(2)将步骤(1)得到的种子液以4％～6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/Vmin，罐压0.02～0.03Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到12～16小时时，添加保护剂1，发酵时间为16～20小时，使pH值降至3.6～4.2制成一级种子液，所述一级种子液的浓度为1.3×109cfu/ml～1.6×109cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的一级种子液以6～10％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/V·min，罐压0.04～0.05Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到14～18小时时，添加保护剂2，发酵时间18～24小时，使PH降至3.6～4.2值，制成二级种子液，所述二级种子液的浓度为1.8×109cfu/ml～2.4×109cfu/ml；(4)在无菌环境中，将步骤(3)得到的二级种子液添加保护剂3后，以8～10％的接种量接入灭菌后的麸皮固体培养基中，混合均匀，装袋进培养房培养；培养房培养期间，控制通风量为：3～10换气次数/天，温度34～38℃，湿度80％～90％，培养24～28小时，培养期间翻动麸皮固体培养基1～2次，由此制备得到含水分的粪肠球菌微生物制剂，所述含水分的粪肠球菌微生物制剂的含水量为35～40％，有效活菌数为1.5×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g；(5)将步骤(4)得到的含水分的粪肠球菌微生物制剂移入热风循环干燥烘箱，先46～48℃条件下处理1.5～2.0小时，然后在温度40～43℃烘干，制备得到高活性粪肠球菌微生物制剂干粉，所述高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的含水量为8～10％，有效活菌数为1.3×1010cfu/g～1.8×1010cfu/g。...

【技术特征摘要】
1.一种高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将活化的粪肠球菌斜面菌种转入无菌水中，形成种子液，所述种子液的浓度为5.0×108cfu/ml～1.0×109cfu/ml；(2)将步骤(1)得到的种子液以4％～6％的接种量转接到含有一级发酵培养基的发酵罐中，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/Vmin，罐压0.02～0.03Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到12～16小时时，添加保护剂1，发酵时间为16～20小时，使pH值降至3.6～4.2制成一级种子液，所述一级种子液的浓度为1.3×109cfu/ml～1.6×109cfu/ml；(3)将步骤(2)得到的一级种子液以6～10％的接种量转接到含有二级发酵培养基的发酵罐中进行二级发酵，发酵温度37±1℃，搅拌速率0rpm，通气量0V/V·min，罐压0.04～0.05Mpa，溶氧浓度5～10％，培养到14～18小时时，添加保护剂2，发酵时间18～24小时，使PH降至3.6～4.2值，制成二级种子液，所述二级种子液的浓度为1.8×109cfu/ml～2.4×109cfu/ml；(4)在无菌环境中，将步骤(3)得到的二级种子液添加保护剂3后，以8～10％的接种量接入灭菌后的麸皮固体培养基中，混合均匀，装袋进培养房培养；培养房培养期间，控制通风量为：3～10换气次数/天，温度34～38℃，湿度80％～90％，培养24～28小时，培养期间翻动麸皮固体培养基1～2次，由此制备得到含水分的粪肠球菌微生物制剂，所述含水分的粪肠球菌微生物制剂的含水量为35～40％，有效活菌数为1.5×1010cfu/g～2.0×1010cfu/g；(5)将步骤(4)得到的含水分的粪肠球菌微生物制剂移入热风循环干燥烘箱，先46～48℃条件下处理1.5～2.0小时，然后在温度40～43℃烘干，制备得到高活性粪肠球菌微生物制剂干粉，所述高活性粪肠球菌微生物制剂干粉的含水量为8～10％，有效活菌数为1.3×1010cfu/g～1.8×1010cfu/g。2.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻小燕，刘海龙，
申请(专利权)人：广州同心源生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44