本发明专利技术公开了一种高粘附益生性屎肠球菌(Enterococcus faecium)及其应用，该屎肠球菌的保藏编号为CGMCC NO.13229。本发明专利技术的屎肠球菌具有较强的抗逆性，能够耐高温、耐酸、黏附性能好，还具有优良的益生性，能够提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收，促进动物生长；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；具有无污染，无残留，生物环保等特点。本发明专利技术的屎肠球菌可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。
A highly adhesive and beneficial Enterococcus faecium and its application
The invention discloses a highly adherent and beneficial Enterococcus faecium (Enterococcus faecium) and its application. The preservation number of the Enterococcus faecium is CGMCC NO.13229. The Enterococcus faecium has strong resistance to high temperature, acid and adhesion, and has good probiotics. It can improve feed utilization, promote digestion and absorption of nutrients in feed, promote animal growth, enhance the immune function of animals, raise daily weight gain, reduce the ratio of meat and meat, and have no Pollution, no residue, environmental protection and other characteristics. The Enterococcus faecium of the invention can be used as a new probiotics additive and widely used in feed.
【技术实现步骤摘要】
一种高粘附益生性屎肠球菌及其应用
本专利技术属于微生物应用
，具体地说，涉及一种高粘附益生性屎肠球菌及其应用。
技术介绍
在养殖业中动物发生疾病会造成很大的经济损失，如肠炎、腹泻等，很多都是由病原菌引起的，并且对于人类的健康也造成着一定的威胁。随着抗生素的发现使这一状况得以改善，抗生素可以在短时间内杀死致病菌，能有效地治疗细菌性疾病，并且抗生素还能促进动物的生长。所以抗生素可以用于治疗和预防一些疾病，还可以用作促生长剂。但是随着科学的进步，抗生素的弊端也渐渐被人们发现。随着人们对畜产品安全和环境保护意识的不断加强，作为抗生素的替代品，益生菌越来越多的应用于动物营养和饲料中。益生菌是一类能改善动物胃肠道微生态平衡，有益于动物健康和生产性能发挥的微生物添加剂。其主要作用效果体现在改善动物新陈代谢，提高营养物质吸收和利用，提高免疫力，减少环境污染等方面发挥重要作用。益生菌被允许使用于饲料添加利，能通过黏附机制和竞争性抑制等作用阻止肠道中的有害微生物的生长繁殖，并且其代谢产物能杀死病原菌，具备维持动物肠道微生物的稳态、促进动物的生长、预防和治疗疾病等功效，并能降低动物的死亡率。其不仅解决了抗生素对肠道内正常微生物的不良影响的问题，还能避免使用抗生素而产生副作用以及抗药性等等。屎肠球菌(Enterococcusfaecium)是动物肠道正常乳酸菌类，革兰氏阳性，兼性厌氧，无芽孢和鞭毛的椭球形或球形菌。生长温度为30～40℃，最适温度为35～38℃，适宜的pH为5.0～7.5，抗逆性较差，代谢产生大量乳酸。研究发现屎肠球菌能够增强仔猪的免疫系统功能，并改善肠道菌群结构从而促进断奶仔猪的生长，可以降低肉鸡盲肠大肠杆菌数量增加乳酸杆菌的数量，并使肠道菌群处于稳定的状态，还能提高产蛋后期的产蛋率、产蛋数量以及蛋重。屎肠球菌对免疫器官、肠道绒毛发育、肠道微生物的数量和多样性产生影响，对肉鸡肠道黏膜的定量蛋白质组学分析发现屎肠球菌与42种肠黏膜蛋白物质代谢、免疫和抗氧化系统以及细胞结构有关。益生菌发挥益生作用的前提是黏附定植在肠道上皮中，并且其黏附定植具有宿主特异性，同源益生菌的饲用效果要优于异源，细菌只能定植于同源动物的消化道上皮细胞表面。所以想要获得良好的动物饲用的益生菌需要从动物体内分离和筛选。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高粘附益生性屎肠球菌及其应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术的屎肠球菌是从鸡肠道混合菌中分离出，经过菌落形态观察、黏附及抑菌性能试验等获得目标菌株，经16SrDNA基因序列分析，屎肠球菌16SrDNA扩增电泳图如图1。将菌株屎肠球菌的16SrDNA的序列与GenBank中已知序列进行Blast比对，从数据库中获得相关的种属的16SrDNA，并通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16SrDNA序列等实验数据综合确定该菌株属于肠球菌属，最终确定为厚壁菌门，杆菌纲，乳杆菌目，肠球菌科，肠球菌属的屎肠球菌(Enterococcusfaecium)。该菌株黏附性能好，耐受性强，体外益生效果评价，该菌株为能够抑制病原菌且具有益生和提高动物的饲料利用率的效果，其16SrDNA序列如SEQIDNO.1所示。该菌株已于2016年11月2日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，分类命名为屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，保藏号为CGMCCNo.13229。屎肠球菌(Enterococcusfaecium)的微生物学特性为：革兰氏阳性菌，在MRS培养基上生长迅速，37℃培养24h形成乳白色、圆形、表面光滑湿润、凸起、边缘整齐、直径约1mm左右。本专利技术提供含有该屎肠球菌的菌剂。本专利技术提供含有该屎肠球菌的药物。本专利技术提供了含有该屎肠球菌的动物饲料添加剂。该饲料添加剂含有屎肠球菌的活菌数为5×108-1×109CFU/kg。本专利技术通过体外法鉴定了屎肠球菌的益生效果，结果表明，屎肠球菌能够耐酸、耐高温、能抵抗胃肠道的内环境，具备益生菌的潜力。本专利技术还采用体外法鉴定屎肠球菌的抑菌性能、粘附性能和安全性能，结果显示：本专利技术的屎肠球菌，最适pH5.0-7.0，该菌在MRS培养基中能迅速繁殖，生长OD值如图2所示，该菌在2h后进入对数期，8h后即达到稳定期，且稳定期后菌浓度在较长一段时间内能保持稳定。稳定后菌液浓度能达到3.3×108-5.0×108CFU/mL。本株屎肠球菌还具有一定的耐高温性能，在65℃加热160s后存活率能达到76％以上，75℃加热160s后存活率能达到30％以上，85℃加热160s存活率能达到23％以上。该株菌具有耐受胆盐以及胃蛋白酶的能力。在培养基中加入0.1％、0.2％、0.3％以及0.5％的胆盐培养24h以后，菌液浓度均能达到3.5×107-5.8×107CFU/mL。在培养基中添加0.5％的胃蛋白酶作为模拟胃液，37℃培养2h后，菌的存活率能达到82％以上。能够耐受体内环境，具有较高的粘附力，具有良好的益生效果。通过在肉鸡饲料添加中应用效果的研究，表明屎肠球菌可作为一种新型的益生菌添加剂，广泛应用于饲料中。本专利技术筛选得到的屎肠球菌具有提高饲料利用率，促进饲料中营养物质的消化吸收；增强动物的免疫功能，提高日增重，降低料肉比；无污染，无残留，生物环保等特点，具有更好的益生特性和用作饲料添加剂的潜力。附图说明图1为屎肠球菌16SrDNA扩增电泳图。左侧是maker，右侧是目的条带。图2为菌在MRS培养基中随时间延长的生长OD值图。图3为初筛得到的6株菌，编号A-F，在不同pH值条件下的生长情况图。图4为为初筛得到的6株菌，编号A-F，在不同温度条件下的生长情况图。图5为A菌株和F菌株的黏附性试验结果。图6为F菌株(PNC01)对Caco-2细胞上清液LDH含量的影响。对照组为不添加F菌。图7为F菌株(PNC01)在不同胆盐浓度下的耐胆盐试验结果图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1屎肠球菌的分离和鉴定1、屎肠球菌的分离纯化及保存从鸡的嗉囊、空肠、回肠、盲肠采集粘膜及些许食糜至于已灭菌的离心管中，样品中加入灭菌生理盐水(PBS缓冲液)混匀，吸取悬浊液用灭菌生理盐水(PBS缓冲液)倍比稀释，稀释浓度梯度为10-1到10-10，稀释后选取10-4到10-10的样品，每个稀释浓度取100uL均匀涂在乳酸菌的选择性琼脂培养基(MRS琼脂培养基，所用MRS琼脂培养基组成为：牛肉粉5.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸二氢钾2.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，吐温801mL，蒸馏水1000mL，pH6.2±0.1。)上，将培养皿倒置放入37℃培养箱中培养48h，获得单个菌落。从培养皿上挑选菌落形态不相同单菌落接种在灭菌的MRS液体培养基中(所用MRS液体培养基组成为：牛肉粉5.0g，蛋白胨10.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，乙酸钠5.0g，磷酸二氢钾2.0g，柠檬酸三铵2.本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种屎肠球菌(Enterococcus faecium)，其名为PNC01，其保藏编号为CGMCC NO.13229。
【技术特征摘要】
1.一种屎肠球菌(Enterococcusfaecium)，其名为PNC01，其保藏编号为CGMCCNO.13229。2.含有权利要求1所述的屎肠球菌的菌剂。3.权利要求1所述屎肠球菌或权利要求2所述的菌剂在制备益生菌中的应用。4.含有权利要求1所述屎肠球菌或权利要求2所述的菌剂的药物。5.权利要求1所述的屎肠球菌或权利要求2所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：张炳坤，刘璇，呙于明，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11
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