基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法技术
【技术实现步骤摘要】
基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法
本专利技术涉及一种生物标志物检测方法，具体是一种基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法。
技术介绍
随着人类基因组计划(humangenomicproject，HGP)的完成，人们逐渐将研究靶向转变对蛋白质组(proteome)的研究。蛋白质组一词是在1994年由Williams和Wilkins提出，指基因组编码的所有蛋白质，即某一物种、个体、器官、组织乃至细胞的全部蛋白质，强调基因组对应的所有蛋白质构成的整体。2001年，Nature和Science在公布人类基因组草图的同时，分别发表了Abbott和Fields的评述与展望。随之，蛋白质组学的地位提升到了前所未有的高度，被认为是功能基因组学前沿研究战略的制高点、决胜点。蛋白质组学(proteomics)是一种新兴的科学研究技术，其有别于传统的单个基因或单个蛋白的研究模式，而是从整体水平分析机体或细胞全部蛋白质组成成分、表达、修饰、结构功能和相互作用，以及蛋白质和核酸之间的相互作用，对生命的复杂活动有全面和本质的认识，从整体层次上对蛋白质进行动态研究...
【技术保护点】
基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于‑80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计...
【技术特征摘要】
1.基于唾液蛋白质组学的肝癌脾虚证生物标志物检测的方法，其特征在于，具体步骤如下：(1)样品蛋白提取：样本中加入5％的裂解缓冲液进行涡旋混匀，超声60s，振幅22％室温提取30min；15000r/min、4℃离心20min，取出上清；收集上清，分装分装后冻存于-80℃；(2)蛋白定量：采用Bradford法测定提取的蛋白浓度，先将样本用裂解缓冲液进行一定倍数稀释使其终浓度落在标曲范围内，稀释好的样本和标准品各取10μl分别和300μl蛋白定量染料避光反应20min，用酶标仪同时测定标准品和样本在595nm下的吸光值，根据标准品每管吸光值和浓度的关系绘制标准曲线，根据曲线公式计算各样品蛋白浓度；(3)蛋白酶解：蛋白定量后取200μg蛋白溶液置于离心管中；加入4μl还原剂，60℃反应1h；加入2μl的半胱氨酸阻断剂，室温反应10min；将还原烷基化后的蛋白溶液加入10K的超滤管中，12000r/min离心20min，弃掉收集管底部溶液；加入iTRAQ试剂盒中的溶液缓冲液100μl，12000转离心20min，弃掉收集管底部溶液，重复3次；更换新的收集管，在超滤管中加入胰蛋白酶，总量4μg，体积50μl，37℃反应过夜；次日，12000r/min离心20min，酶解消化后的肽段溶液离心于收集管底部；在超滤管中加入50μl溶解缓冲液，12000r/min再次离心20min，与上步合并，收集管底部共得到100μl酶解后的样品；(4)iTRAQ标记：从冰箱中取出iTRAQ试剂，平衡到室温，将iTRAQ试剂离心至管底；向每管iTRAQ试剂中加入150μl异丙醇，涡旋振荡，离心至管底；取50μl酶解后的样品转移到新的离心管中；将iTRAQ试剂添加到样品中，涡旋振荡，离心至管底，室温反应2h；加入100μl水终止反应；从4组样品中各取出1ul混合，用Ziptip脱盐后进行MALDI-TOF-TOF鉴定，确认标记反应良好；混合标记后的样品，涡旋振荡，离心至管底；真空冷冻离心干燥；抽干后的样品冷冻保存待用；(5)高pH条件下的反相色谱分离：所需试剂的调配：流动相A：98％ddH2O，2％乙腈，pH10；流动相B：98％乙腈，2％ddH2O，pH10；ddH2O用氨水调pH值到10；混合标记后的样品用100ul流动相A溶解，14000r/min离心20min，取上清待用；使用400μg酶解好的BSA进行分离，检测系统情况；取100ul准备好的样本上样；流速0.7ml/min，得到分离梯度数据；(6)ABI-5600进行蛋白质分析：所需试剂的调配：流动相A：100％超纯水，0.1％甲酸；流动相B：100％乙腈，0.1％甲酸；将高pH反相分离得到的组份用20μl2％甲醇，0.1％甲酸复溶；12000r/min离心10min，吸取上清上样，上样体积10μl，采取夹心法上样；装载泵流速350nl/min，15min；分离流速350nl/min，得到分离梯度数据；(7)质谱数据分析：在选择数据库时，若为已经测序生物，直接选用该物种数据库，若为非测序生物，则选择与被测样品最为相关的大类蛋白质组数据库；采用ABI-5600型质谱仪进行iTRAQ的质谱分析；(8)检测结果：对肝癌脾虚证和正常对照组进行对比实验，定量蛋白质组学研究结果显示：鉴定1297个蛋白；与正常对照组相比，肝癌脾虚证中鉴定到的1.5倍以上表达差异的显著差异蛋白共140个，其中上调蛋白64个，下调蛋白76个；差异蛋白列表如下：上调蛋白如下：1)检索号为Q66K66，基因注释为Transmembraneprotein198；2)检索号为Q9ULD9，基因注释为Zincfingerprotein608；3)检索号为Q8IVF7，基因注释为Formin-likeprotein3；4)检索号为O60282，基因注释为Kinesinheavychainisoform5C；5)检索号为Q86V2，基因注释为Kinesin-likeproteinKIF27；6)检索号为P06727，基因注释为ApolipoproteinA-IV；7)检索号为P13473，基因注释为Lysosome-associatedmembraneglycoprotein2；8)检索号为P31151，基因注释为ProteinS100-A7；9)检索号为O75629，基因注释为ProteinCREG1；10)检索号为P35321，基因注释为Cornifin-A；11)检索号为Q9Y239，基因注释为Nucleotide-bindingoligomerizationdomain-containingprotein1；12)检索号为Q9BRA2，基因注释为Thioredoxindomain-containingprotein17；13)检索号为Q07654，基因注释为Trefoilfactor3；14)检索号为P31949，基因注释为ProteinS100-A11；15)检索号为Q96RM1，基因注释为Smallproline-richprotein2F；16)检索号为Q6ZUA9，基因注释为Maestroheat-likerepeatfamilymember5；17)检索号为P68032，基因注释为Actin,alphacardiacmusle1；18)检索号为P01598，基因注释为IgkappachainV-IregionEU；19)检索号为P01708，基因注释为IglambdachainV-IIregionBUR；20)检索号为P83593，基因注释为IgkappachainV-IVregionSTH(Fragment)；21)检索号为P02814，基因注释为Submaxillaryglandandrogen-regulatedprotein3B；22)检索号为Q6P158，基因注释为PutativeATP-dependentRNAhelicaseDH57；23)检索号为Q9UBH0，基因注释为Interleukin-36receptorantagonistprotein；24)检索号为P49221，基因注释为Protein-glutaminegamma-glutamyltransferase4；25)检索号为P00480，基因注释为Ornithinecarbamoyltransferase,mitochondrial；26)检索号为P68871，基因注释为Hemoglobinsubunitbeta；27)检索号为P01871，基因注释为IgmuchainCregion；28)检索号为O75038，基因注释为1-phosphatidylinositol4,5-bisphosphatephosphodiesteraseeta-2；29)检索号为P31025，基因注释为Lipocalin-1；30)检索号为P01612，基因注释为IgkappachainV-IregionMev；31)检索号为P19957，基因注释为Elafin；32)检索号为P08697，基因注释为Alpha-2-antiplasmin；33)检索号为P32119，基因注释为Peroxiredoxin-2；34)检索号为Q7L0X2，基因注释为Glutamate-richprotein6；35)检索号为Q9UL2，基因注释为Ras-relatedproteinRab-21；36)检索号为P22528，基因注释为Cornifin-B；37)检索号为Q9Y5Y6，基因注释为Suppressoroftumorigenicity14protein；38)检索号为P69905，基因注释为Hemoglobinsubunitalpha；39)检索号为P01743，基因注释为；IgheavychainV-IregionHG3；40)检索号为Q6ZP82，基因注释为Coiled-coildomain-containingprotein141；41)检索号为Q01469，基因注释为Fattyacid-bindingprotein,epidermal；42)检索号为P01860，基因注释为Iggamma-3chainCregion；43)检索号为P09211，基因注释为GlutathioneS-transferaseP；44)检索号为Q8TED4，基因注释为Sugarphosphateexchanger2；45)检索号为P04179，基因注释为Superoxidedismutase[Mn],mitochondrial；46)检索号为P01624，基因注释为IgkappachainV-IIIregionPOM；47)检索号为P1059，基因注释为Thioredoxin；48)检索号为O95274，基因注释为Ly6/PLAURdomain-containingprotein3；49)检索号为Q9GZN4，基因注释为Brain-specificserineprotease4；50)检索号为Q9ULV4，基因注释为Coronin-1C；51)检索号为P35270，基因注释为Sepiapterinreductase；52)检索号为Q86SG5，基因注释为ProteinS100-A7A；53)检索号为P01764，基因注释为IgheavychainV-IIIregion23；54)检索号为P06870，基因注释为Kallikein-1；55)检索号为Q96PD5，基因注释为N-acetylmuramoyl-L-alanineamidase；56)检索号为Q9UHY7，基因注释为Enolase-phosphataseE1；57)检索号为Q3ZCW2，基因注释为Galectin-relatedprotein；60)检索号为Q92692，基因注释为Nectin-2；61)检索号为P01834，基因注释为IgkappachainCregion；62)检索号为P00915，基因注释为Carbonicanhydrase1；63)检索号为P01771，基因注释为IgheavychainV-IIIregionHIL；64)检索号为P01857，基因注释为Iggamma-1chainCregion；65)检索号为P04220，基因注释为Igmuheavychaindiseaseprotein；66)检索号为P00450，基因注释为Ceruloplasmin；67)检索号为P00734，基因注释为Prothrombin；68)检索号为Q6MZM9，基因注释为Proline-richprotein27；69)检索号为P01610，基因注释为IgkappachainV-IregionWEA；70)检索号为P02763，基因注释为Alpha-1-acidglycoprotein1；71)检索号为P15328，基因注释为Folatereceptoralpha；72)检索号为P02042，基因注释为Hemoglobinsubunitdelta；73)检索号为O60701，基因注释为UDP-glucose6-dehydrogenase；74)检索号为O00154，基因注释为CytosolicacylcoenzymeAthioesterhydrolase；75)检索号为P41439，基因注释为Folatereceptorgamma；76)检索号为Q14126，基因注释为Desmoglein-2；77)检索号为Q92734，基因注释为ProteinTFG；78)检索号为Q92876，基因注释为Kallikrein-6；79)检索号为O60635，基因注释为Tetraspanin-1；80)检索号为P19404，基因注释为NADHdehydrogenase[ubiquinone]flavoprotein2,mitochondrial；81)检索号为P02787，基因注释为Serotransferrin；82)检索号为P22532，基因注释为Smallproline-richprotein2D；83)检索号为B3EWG3，基因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【专利技术属性】
技术研发人员：吴正治，曹美群，丁峰，孙珂焕，黄飞娟，范大华，姚永超，
申请(专利权)人：深圳市老年医学研究所，吴正治，
类型：发明
国别省市：广东,44
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