可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种可支持人源饲养层细胞可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、将人骨髓间充质干细胞置于培养基中进行传代培养；S2、将含有潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞，得到人骨髓间充质干细胞；S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染人骨髓间充质干细胞，得到TW2R细胞；S4、将含有E‑cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒染入TW2R细胞，得到TWE3R细胞。本发明专利技术制得的人源饲养层细胞可稳定表达E‑cadherin蛋白，而且稳定表达E‑cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力。

Preparation method of human feeder cells supporting human embryonic stem cell growth

The present invention provides a preparation method for human source feeder cells that can support human embryonic stem cells to support the growth of human embryonic stem cells, including the following steps: S1, placing human bone marrow mesenchymal stem cells in culture medium for subculture; S2, transmission of retroviral particles containing the hygromycin resistant gene in S1 Human bone marrow mesenchymal stem cells were cultured, and human bone marrow mesenchymal stem cells were obtained. S3, retroviral particles containing Wnt3a gene and neomycin resistant gene infected human bone marrow mesenchymal stem cells, and TW2R cells were obtained. S4, lentivirus particles containing E cadherin gene and purinamycin resistance gene into TW2R cells. TWE3R cells were obtained. The human feeder layer cells produced by the invention can express the E cadherin protein stably, and the stable expression of E cadherin gene does not affect the proliferation of TWE3R cells.

【技术实现步骤摘要】
可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法。
技术介绍
人胚胎干细胞在转化医学、再生医学以及新药筛选方面有着广阔的运用应用前景，而目前人胚胎干细胞(hESC)的培养，一般都需要小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层细胞，但是使用这些动物源性材料会给今后临床运用带来一定的生物安全问题。此外，由于一般只能用5代之内MEF作为饲养层来培养人胚胎干细胞，而不同批次胎鼠来源的MEF之间存在差异，维持人胚胎干细胞多能性生长的能力也不一样，这些都会给人胚胎干细胞的体外长期培养带来不稳定性。虽然加拿大著名的STEMCELL公司最近研发的TeSRTM-E8TM是一种成分高度确定、无需饲养层细胞(feeder-free)的培养基，适用于人胚胎干细胞的培养，尽管TeSR-E8培养基能够在没有动物蛋白的情况下支持干细胞的生长，但其中添加了人血清白蛋白和人源基质蛋白，这就使得培养条件极其昂贵，不适合常规使用。因此，研究和开发可支持人胚胎干细胞生长的永生化人源性饲养层细胞对于今后人胚胎干细胞运用于临床有着重要意义。E-cadherin(钙黏着素E)是钙依赖性黏附分子的亚族成员，是一种跨膜蛋白，广泛分布在非神经上皮组织，它与细胞内的特异性分子结合，参与同种亲和性的细胞-细胞间的黏附，胚胎发育以及正常组织中上皮细胞层的形成和维持。此外有研究显示在维持胚胎干细胞的多能性方面，E-cadherin也起着重要作用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是解决上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本专利技术还有一个目的是提供一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，制得的人源饲养层细胞可稳定转染E-cadherin基因从而稳定表达E-cadherin蛋白，而且稳定表达E-cadherin基因后不会影响TWE3R细胞的增殖能力。为了实现根据本专利技术的这些目的和其它优点，提供了一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，包括以下步骤：S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycinB进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；A2、在容器一中加入OPTI-MEM、然后依次加入hTERTRV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器二中加入OPTI-MEM、Lipofectamine2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒；其中，hTERTRV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine2000的质量体积比为14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；B2、在容器三中加入OPTI-MEM、然后依次加入Wnt3aRV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器四中加入OPTI-MEM、Lipofectamine2000，混合均匀；将容器三和容器四中的原料混合均匀；B3、将容器三和容器四中混合后的原料加入B1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒；其中，Wnt3aRV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine2000的质量体积比为14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S4中含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒为LV6-homoE-cadherin病毒颗粒。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中传代培养的条件为于CO2体积浓度为5～10％、温度为36～37℃下培养60～80h。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，A3中培养48h后，收集细胞上清液，然后再向混合后的原料中加入体积与A1中DMEM体积相等的的含有FBS不含抗生素的高糖DMEM，培养72h后，再次收集细胞上清液，合并两次细胞上清液，浓缩得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒，其中，FBS的体积分数为1％。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中使用50ug/ml的hygromycinB进行筛选；S3中使用500ug/ml的G418进行筛选；S4中使用1ug/ml的puromycin进行筛选。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S1中将105个人骨髓间充质干细胞置于1.9～2.1ml的MSC培养基中进行传代培养。优选的是，所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，S2中将125～250μl的含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染105个S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中；S3中将125～250μl的含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染105个S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycin B进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；S4、将含有E‑cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E‑cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。

【技术特征摘要】
1.一种可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将人骨髓间充质干细胞置于MSC培养基中进行传代培养；S2、将含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S1中传代培养的人骨髓间充质干细胞中，然后加入hygromycinB进行筛选，得到含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞；S3、将含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒感染S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的人骨髓间充质干细胞中，然后加入G418进行筛选，得到含有hTERT基因、潮霉素抗性基因、Wnt3a基因、新霉素抗性基因的TW2R细胞；S4、将含有E-cadherin基因和嘌呤霉素抗性基因的慢病毒颗粒感染S3中TW2R细胞中，然后加入puromycin进行筛选，得到过表达E-cadherin的TWE3R细胞，即为人源饲养层细胞。2.如权利要求1所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，S1中MSC培养基为每毫升培养基中含有0.08～0.1mL的胎牛血清、0.01～0.015mL的Antibiotic-Antimycotic、0.9～1.1ng的bFGF、以及余量的DMEM。3.如权利要求1所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，S2中含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：A1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，FBS的体积分数为1％；A2、在容器一中加入OPTI-MEM、然后依次加入hTERTRV-Vector、Gag/pol、VSV-G的病毒质粒，混匀，静置；在容器二中加入OPTI-MEM、Lipofectamine2000，混合均匀；将容器一和容器二中的原料混合均匀；A3、将容器一和容器二中混合后的原料加入A1中的预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，混匀，置于培养箱培养48h后，收集含有病毒颗粒的细胞上清液，浓缩，得含有hTERT基因和潮霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒；其中，hTERTRV-Vector、Gag/pol、VSV-G、OPTI-MEM、DMEM、Lipofectamine2000的质量体积比为14.9～15.1μg:5.8～6.1μg:2.8～3.2μg:1ml:18～20ml:34～36μl。4.如权利要求1所述的可支持人胚胎干细胞生长的人源饲养层细胞的制备方法，其特征在于，S3中含有Wnt3a基因和新霉素抗性基因的逆转录病毒颗粒的制备方法包括以下步骤：B1、将293T细胞接种至预先包被多聚赖氨酸溶液的培养皿中，加入含有FBS、不含抗生素的高糖DMEM，培养24h，其中，F...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹春林，滕夏虹，王丽惠，许倩倩，孙晓婷，卢奕，张健，
申请(专利权)人：广西医科大学，
类型：发明
国别省市：广西,45