本发明专利技术公开了一株枯草芽孢杆菌及其在防治国槐腐烂病中的应用。该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LD1，是从山东省东营市盐碱地土壤中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.14680。试验结果表明：枯草芽孢杆菌菌株LD1生物防治制剂防治国槐腐烂病效果显著，防治效果达到76.85％，且国槐生长健壮，无药害产生。
Bacillus subtilis and its application in the control of rot disease of Sophora japonica
The invention discloses a Bacillus subtilis and its application in preventing and curing the rot disease of Sophora japonica. The strain, Bacillus subtilis strain LD1, was isolated from the saline alkali soil of Dongying City, Shandong province. In September 26, 2017, the strain was preserved in the common microorganism center of the Chinese microbe preservation management committee, and the preservation number was CGMCC No.14680. The results showed that the biocontrol preparation of Bacillus subtilis LD1 was effective in preventing and controlling Sophora japonica rot, the control effect reached 76.85%, and the growth of Sophora japonica was strong and no drug damage was produced.
【技术实现步骤摘要】
一株枯草芽孢杆菌及其在防治国槐腐烂病中的应用
本专利技术属于植物病害生物防治
具体而言，本专利技术涉及一株枯草芽孢杆菌及其在防治国槐腐烂病中的应用，以及采用该芽孢杆菌制备的生物防治制剂。
技术介绍
国槐腐烂病，又称国槐烂皮病。该病由两种病原菌引起，分别为镰刀菌引起的镰刀菌型腐烂病和小穴壳菌型腐烂病。国槐腐烂病的发生会对国槐的生长造成危害，尤其是新栽植的幼树发病较为严重，严重影响国槐的生态生长和观赏价值，甚至导致死亡。目前，对国槐腐烂病的防治，采用的常规方法包括传统的化学防治、培育抗病品种以及生物防治。化学防治极易造成农药残留，环境污染，同时化学农药的长期使用，使得病原菌产生抗药性，导致防治效果下降甚至失败；而抗病品种培育周期长，抗性单一；生物防治主要是利用有益的微生物，通过生物间的竞争作用、抗菌作用、重寄生作用、交叉保护作用及诱发抗病性等来抑制某些病原菌的存活和活动，具有无毒、无污染、不产生抗药性、高效的优点，表现出广阔的应用前景。芽孢杆菌是一类好氧或兼性厌氧的产芽孢革兰氏阳性杆菌的总称，其生理特征丰富多样，在自然界中广泛存在，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种抗菌素和酶，具有广谱抗菌活性。芽孢杆菌突出的特征是能产生内生耐热以及对紫外线、电磁辐射及一些化学药品有很强的抗逆性的芽孢，这有利于生防菌剂的生产和剂型加工，也利于其在环境中的存活、定殖与繁殖。由于芽孢杆菌生长速度快、营养需求简单、能够形成抗逆性较强的芽孢，在产品开发中较非芽孢杆菌具有有效活菌数量高、性能稳定等优势而备受瞩目。芽孢杆菌是植物病害生防微生物的重要组成部分，可用于防治多种植物病害。芽孢杆菌作为生防菌防治植物病害的机制主要有：抗生作用、营养竞争、空间竞争、重寄生作用以及诱导植物产生抗性等机制，其主要的生防机制是以产生拮抗物质抑制有害病菌的生长或杀死病原菌。这些物质绝大多数为肽类抗生素，具有高效、低残留、与环境友好等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于高效防治国槐腐烂病的新的微生物——枯草芽孢杆菌菌株LD1。本专利技术的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物(尤其是国槐)表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案实现的：本专利技术所提供的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株LD1，是从山东省东营市盐碱地土壤中分离获得的，已于2017年9月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNo.14680。其具有以下生物学特性：在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基或LB(Luria-Bertani)培养基上菌落形态为圆形或不规则形，乳白偏黄色，表面粗糙起褶皱，在牛肉膏蛋白胨琼脂培养基上，28℃下培养两天后，镜检，菌体细胞呈杆状，能运动。经革兰氏染色呈阳性(以大肠杆菌为对照)。经芽孢染色后观察芽孢呈椭圆形或柱状。本专利技术枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1的培养方法或繁殖方法包括：(1)普通培养保存采用LB培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，琼脂15～20g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。(2)实验室液体培养采用LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。(3)固体培养基配方：包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁7％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙65％。(4)大量发酵培养配方：同(3)中固体培养基配方。本专利技术还提供一种用于防治国槐腐烂病的生物防治制剂，所述生物防治制剂包括所述的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1。本专利技术还提供了一种用于防治国槐腐烂病的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有腐烂病的国槐施用上述枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1或者上述生物防治制剂。本专利技术也提供了上述枯草芽孢杆菌菌株LD1或者上述生物防治制剂在防治国槐腐烂病中的用途。本专利技术所述的生物防治制剂的制备方法包括以下步骤：(1)制备所述枯草芽孢杆菌菌株LD1的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，并用灭菌纱布过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。在本专利技术的一个具体实施方案中，所述制备方法包括以下步骤：(1)将所述枯草芽孢杆菌菌株LD1的孢子移植到LB液体培养基，28～30℃摇床振荡培养3～5d得到种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液按质量比10％的比例接种到固体培养基中，28～30℃下振荡培养3～5d；(3)将步骤(2)培养的培养物用无菌水按质量比1∶15的比例混合，并用灭菌纱布过滤，将滤液按体积比1∶6的比例接种至大量发酵培养基，室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中发酵培养8～9d。其中，步骤(1)中的LB液体培养基，配方为：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，蒸馏水1000mL，pH调至7.2～7.4。步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比为：磷酸二氢钾18％，硫酸镁7％，硫酸铵10％，轻质碳酸钙65％。步骤(3)中的大量发酵培养基同步骤(2)的固体培养基。实验表明，本专利技术的枯草芽孢杆菌菌株具有生长速度快、产量大、抗逆性强，在植物表面能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。由该枯草芽孢杆菌制备的生物防治制剂能够高效的防治国槐腐烂病，是一种极具应用前景的生物防治制剂。试验结果表明：枯草芽孢杆菌(B.subtilis)菌株LD1固体发酵培养物防治国槐腐烂病效果显著，防治效果达到76.85％，且国槐生长健壮，无药害产生。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均在本专利技术的保护范围内。实施例11、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1的分离与纯化本专利技术的枯草芽孢杆菌(B.subtilis)LD1是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：(1)芽孢杆菌的分离土样于2015年5月采集自山东省东营市盐碱地，采用5点取样法，分别采集样地四周和中央的10～20cm土层的土壤，等量混匀。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150rpm震荡10min，然后置于60℃水浴锅中孵育30min，取100μL10-2、10-3、10-4稀释液涂布于LB培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养2d后挑取LB本文档来自技高网...
【技术保护点】
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株LD1，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.14680。
【技术特征摘要】
1.枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株LD1，所述菌株的保藏编号为CGMCCNo.14680。2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株LD1在防治国槐腐烂病中的用途。3.一种生物防治制剂，包括权利要求1所述的枯草芽孢杆菌菌株LD1。4.权利要求3所述的生物防治制剂的制备方法，包括以下步骤：(1)制备枯草芽孢杆菌菌株LD1的种子液；(2)将步骤(1)制备的种子液接种到固体培养基中，28～30℃下恒温培养；(3)将步骤(2)培养的培养物加入无菌水混合，过滤，将滤液接种至大量发酵培养基，在室温28～30℃、相对湿度85％以上的发酵室中进行发酵培养。5.如权利要求4所述的生物防治制剂的制备方法，其特征是，所述步骤(2)中的固体培养基包括固料和无机盐，所述固料和无机盐的质量比98.7∶0.3；所述固料按质量比计为，稻壳∶玉米粉∶豆粕粉∶麸皮＝50∶20∶25∶5；所述无机盐的组分及质量比...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙涛，丁传山，孙淑建，张薇，刘贵民，季延平，牛赡光，
申请(专利权)人：济南美华景观设计工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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