一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用，所述鼠李糖乳杆菌其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌（

Lactobacillus rhamnophilus and its application in the preparation of bacteriocin

The present invention discloses a Lactobacillus Rhamnus and its application in preparing bacteriocin, and the classification name of Lactobacillus Rhamnus is called Lactobacillus Rhamnus (Rhamnus rhamnose).

【技术实现步骤摘要】
一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用
本专利技术属于食品微生物
，具体涉及一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用。
技术介绍
食品安全是人们选择食品的重要方面，其中食源性微生物引发的疾病在发达和发展中国家均广泛存在，严重威胁公共健康。经过多年研究，与危害健康相关的食品病原微生物已经得到鉴定，比如沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)和大肠杆菌(Eschericiacoli)，这两种菌引起75％的食源性疾病。通过化学药物可以抑制病原菌的生长，但是抗生素的滥用使病原菌产生耐药性，严重威胁人类的健康，所以天然产物得到越来越多的重视。细菌素是由乳酸菌产生的具有抑菌活性肽类或蛋白类物质，具有广泛的抑菌谱，可用于食品的防腐。产生细菌素的菌种来源于食品、动物、植物和临床样品，而且不同的菌种产生的细菌素种类不尽相同，如nisin(Lactococcussp.)、pediocin(Pediococcussp.)、lactocin(Lactobacillussp.)、enterocin(Enterococcussp.)，革兰氏阳性菌比革兰氏阴性菌产生更多的细菌素。细菌素是一种由细菌核糖体代谢产生的多肽或蛋白类物质，产生细菌素的菌体自身对其免疫，但对多种食源性菌和病原菌有抑制作用，因此细菌素作为防腐剂应用在食品中具有极大的意义。乳酸菌细菌素可以抑制甚至杀死食品中的部分腐败菌和病原菌，是一种天然的食品防腐剂。用乳酸菌发酵乳制品不仅可以增加产品中的活菌数，而且可以延长产品的保质期，其发酵时产生的细菌素具有无毒、无残留、无抗药性、无副作用，有一定的热稳定性，极易被人体内消化道内部分蛋白酶降解，不会在人体内累积，不会引发不良反应等优点。抗生素在食品中通常是禁止使用的，因此寻找一种自然安全的防腐剂便引起人们的日益关注，而细菌素是一种天然、具有抗菌活性的物质，它使用能够部分减少甚至取代抗生素的使用，同时也不会污染环境，因此细菌素作为一种天然的生物防腐剂，受到了大众的关注，逐渐成为人们研究的热点。细菌素多为蛋白类物质，对其基本生化特性进行研究，可以扩大其在食品中的应用。开菲尔粒(Kefirgrains)是传统发酵乳制品开菲尔(Kefir)的发酵剂，其中混有多种活菌，包括乳酸菌和酵母菌，对志贺氏菌，沙门氏菌等病原菌都有强烈的抑制作用，经常食用开菲尔制品可在人体胃肠道中保持有益菌群的优势作用。从开菲尔粒中分离筛选产细菌素的菌株不存在食品安全为题，可用于开发生产天然防腐剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鼠李糖乳杆菌及其在制备细菌素中的应用。为实现上述目的，本专利技术提供了一种鼠李糖乳杆菌(从开菲尔粒中分离筛选得)，其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillusrhamnosus)zrx01；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月18日；保藏号是CGMCCNo.15076。优选的，所述的鼠李糖乳杆菌在制备细菌素中的应用，包括以下步骤：1)发酵液制备：将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃，初始pH6.2，培养18h得到发酵液；2)细菌素提取：将1)制备的发酵液离心(12000g，15min)去菌体沉淀，上清液过0.22μm的微孔滤膜，用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取1h，45℃旋蒸后加入1mL磷酸缓冲液(pH6.8)重溶后进行冷冻干燥得到细菌素。所述MRS液体培养基的组成如下：胰蛋白胨10g，硫酸锰0.25g，葡萄糖20g，乙酸钠5g；，MgSO4﹒7H2O0.58g，柠檬酸氢二胺2g，磷酸氢二钾2g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL。优选的，所述步骤2)中用乙酸乙酯与发酵上清液按体积比1:1混合萃取采用的是超声波-微波协同萃取，将混合液置于超声波微波协同萃取仪中，设置超声功率30W，微波功率200W。本专利技术产生的有益效果是：1、本专利技术从开菲尔粒中筛选出鼠李糖乳杆菌zrx01，来源安全，毒副作用小。2、该菌产细菌素热稳定性较好，121℃高温高压处理30min仍保留70.53％抑菌活性，pH稳定性较好，在pH为3-9的范围内均有抑菌性，在pH4时抑菌活性最强，pH9时仍保留对照组抑菌圈直径的86％，对胃蛋白酶敏感，37℃水浴1h后，残余抑菌活力76.82％。3、本专利技术筛选的鼠李糖乳杆菌zrx01所产细菌素可以抑制多种有害菌，尤其是对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌、单增李斯特氏菌、炭疽杆菌、革兰氏阴性菌大肠杆菌、空肠弯曲杆菌、酸土脂环酸芽孢杆菌有较强的抑制作用，但对植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌等益生菌没有抑制作用，对鼠李糖乳杆菌zrx01自身同大多数细菌素一样无抑制性。附图说明图1是鼠李糖乳杆菌zrx01个体形态特征-呈杆状、单个或成排连接；图2是鼠李糖乳杆菌zrx01系统发育树；图3是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的过氧化氢排除试验结果，图中1和2分别是发酵上清液不用过氧化氢酶处理和发酵上清液用过氧化氢酶处理下的抑菌圈；图4是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的有机酸排除试验结果；图中1-3和CK分别是有机酸(乙酸1、盐酸2、乳酸3)和发酵上清液(CK)处理下的抑菌圈；图5是鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的温度稳定性试验结果；图6为鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的pH稳定性试验结果；图7为鼠李糖乳杆菌zrx01产细菌素的不同蛋白酶作用下稳定性试验结果。具体实施方式实施例1所述鼠李糖乳杆菌zrx01是从开菲尔粒中分离筛选得到，将冻藏zrx01菌株接于MRS培养基中，200r/min、37℃恒温培养24h，作为一级种子液。按2％的接种量将一级种子接种至100mLMRS培养基中，过夜培养作为二级种子液，4℃冰箱备用。将培养好的二级种子液zrx01平板划线于MRS平板上，37℃培养2-3d，观察菌落形态。挑取单菌落经革兰氏染色，于显微镜下观察菌体形态。结果表明菌株zrx01的菌落呈湿润的乳白色液滴状，不透明，质地均匀，边缘整齐。经革兰氏染液染色，显微镜观察，菌体成短杆状的革兰氏阳性菌(图1)。生化特性(表1)显示菌株zrx01可发酵单糖、水杨苷等糖苷，能利用明胶、淀粉大分子物质，不能利用乳糖和三糖中的棉子糖。伏-普实验为阳性，可发酵葡萄产生丙酮等。马尿酸钠和七叶苷显示阳性，说明其可水解七叶苷为厌氧肠道杆菌。挑取单菌落接种于MRS液体培养基(胰蛋白胨10g，硫酸锰0.25g，葡萄糖20g，乙酸钠5g；，MgSO4﹒7H2O0.58g，柠檬酸氢二胺2g，磷酸氢二钾2g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，吐温-801mL，蒸馏水1000mL)中37℃，初始pH6.2，培养18h得到单克隆菌液，呈杆状、单个或成排连接(如图1所示)。取单克隆菌液，使用DNA提取试剂盒按其使用说明进行基因组DNA提取，使用乳酸菌通用引物(引物27F序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，引物1492R序列：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)，16SrDNAPCR扩增，测序结果在NCBI上进行序列比对并采用MEGA5.10建立进化树。该菌的16SrDN本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鼠李糖乳杆菌，其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种鼠李糖乳杆菌，其保藏的分类学名称为：鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）zrx01；保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2017年12月18日；保藏号是CGMCCNo.15076。2.如权利要求1所述的鼠李糖乳杆菌在制备细菌素中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤：1)发酵液制备：将鼠李糖乳杆菌接种到MRS液体培养基中，在37℃，初始pH6.2，培养18h得到发酵液；2)细菌素提取：将1)制备的发酵液离心（12000g，15min）去菌体沉淀，上清液过0.22μm的微孔滤膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：冉军舰，朱明明，焦凌霞，梁新红，赵瑞香，卢艳清，
申请(专利权)人：河南科技学院，
类型：发明
国别省市：河南,41