本发明专利技术提供了一种检测检测溶酶体pH的荧光探针，含有吗啉基团和哌嗪集团；该荧光探针可在不同pH环境下，通过萘酰亚胺部分吗啉基团和哌嗪集团的质子化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过检测不同形态的荧光强度来测定活细胞溶酶体中的pH，特异性高，抗干扰；该探针合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。
Fluorescence probe for detecting lysosome pH and its synthesis method and Application
The present invention provides a fluorescent probe for detection and detection of lysosome pH, which contains morpholine group and piperazine group. The fluorescent probe can produce different morpholine groups and piperazine group under different pH environment by the protonation of some morpholine groups and piperazine group, and the fluorescence intensity of different forms can be detected by the detection of the morpholine group and the protonation of piperazine group. The determination of pH in the lysosomes of living cells is high specificity and anti-interference. The synthesis process of the probe is simple, cheap and easy to obtain, and the preparation cost is low and easy to be popularized.
【技术实现步骤摘要】
一种检测溶酶体pH的荧光探针及其合成方法和应用
本专利技术属于有机小分子荧光探针领域，具体涉及一种基于萘酰亚胺衍生物的检测细胞溶酶体内pH双光子荧光探针及其合成方法。
技术介绍
细胞内pH值作为新陈代谢的一个重要的参数，在细胞周期调控、细胞的增殖与凋亡、离子转运、酶活性、钙调控、肌肉收缩等细胞生理调控和病理过程中发挥着非常重要的作用。同时，细胞的内吞作用以及受体配体的内化作用也同样受细胞内pH的影响。细胞内pH异常会导致生物体内细胞和组织器官的生理功能紊乱、酶和蛋白质活性受到抑制、人体的免疫力下降，最终引发炎症、癌症以及阿尔茨海默症等疾病。研究表明，在细胞凋亡初期，癌细胞通常会产生起细胞内的酸化作用，因此细胞内酸化已成为细胞凋亡的一个重要的早期特征。此外，细胞内pH变化同时与细胞凋亡密切相关。因此，对细胞内pH进行准确地进行原位实时监测，有助于从细胞水平上研究细胞的生理和病理过程。溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，通常具有单层膜包被的囊状结构，多为球形，大小约0.025-0.8微米。溶酶体内含蛋白酶、核酸酶、脂肪酶及硫酸脂酶等许多酶，为细胞内的消化器官，可分解各种蛋白质等大分子物质，具有溶解或消化的功能。溶酶体内的降解酶在弱酸性条件下（pH约为5）发挥最佳活性，但是当溶酶体内的pH异常时由于各种降解酶的活性发生变化，其溶解消化功能会受到不同程度的影响，进而导致类风湿关节炎、肿瘤等疾病的发生。因此，迅速准确地检测细胞内溶酶体的pH值可为研究相关生理和病理过程，以及预防关节炎、癌症等相关疾病提供重要的信息。荧光成像分析法具有灵敏度高、选择性好、响应迅速、操作简单等优点，而且对细胞基本没有损伤，已经广泛用于各种生物小分子的检测。目前，用于检测细胞内pH值的荧光探针也得到了迅速发展，其中一些已经商品化。但是，目前报道的和已经商品化的溶酶体pH荧光探针大都不具备溶酶体靶向，一般对所有细胞都有相应。因此开发新的具有高选择性、高灵敏度、光稳定性及透膜性好，且具有溶酶体靶向的pH荧光探针具有重要的意义。
技术实现思路
针对现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种基于萘酰亚胺衍生物的检测细胞溶酶体内pH双光子荧光探针，该探针选择性好、灵敏度高。本专利技术的另一目的是提供一种上述荧光探针的合成方法，原料易得、合成步骤简单、收率高。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案。一种检测溶酶体pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。一种上述检测溶酶体pH的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将化合物1和羟乙基哌嗪溶于乙二醇单甲醚，在碳酸钾存在下加热反应，反应结束后分离纯化得产物，即检测溶酶体pH的荧光探针：化合物1。所述化合物1与羟乙基哌嗪的摩尔比为1:1-1.2。所述反应温度为120℃，反应时间为4-6h。所述分离纯化步骤为：反应液除溶剂获得固体，然后以二氯甲烷:甲醇=30:1的混合溶剂为洗脱液进行柱层析纯化。所述化合物1的制备方法如下：4-溴-1,8-萘二甲酸酐和氨乙基吗啉以乙醇做溶剂，于80℃回流；然后将反应液冷却室温，其析出沉淀，抽滤、烘干，以二氯甲烷为洗脱液过层析柱纯化：。上述荧光探针在检测细胞溶酶体pH中的应用。本专利技术所述的荧光探针可在不同pH环境下，通过萘酰亚胺部分吗啉基团和哌嗪集团的质子化，生成具有不同荧光发射能力的形态，通过检测不同形态的荧光强度来测定活细胞溶酶体中的pH。本专利技术的有益效果为：本专利技术所述的检测生物细胞及溶酶体中pH的双光子荧光探针可经化学合成获得，合成工艺简单易行，原料廉价易得，制备成本低，易于推广。本专利技术所述的检测生物细胞及溶酶体中pH的双光子荧光探针具有高特异性，在进行相应pH检测过程中不受其他组分的干扰，可用于活细胞中溶酶体内pH检测，具有广阔的应用前景。本专利技术所述的检测细胞内溶酶体pH的荧光探针灵敏度高，具有良好的荧光发射光谱特性（400-500nm），通过绘制标准曲线进行细胞内溶酶体pH测定，可以实现对细胞中的pH快速准确检测的目的。附图说明图1是荧光探针的1HNMR图谱；图2是荧光探针在不同pH条件下的荧光光谱；图3是荧光探针对不同pH的荧光强度与线性关系范围；图4是荧光探针与不同物质反应后的荧光光谱；图5是荧光探针与Lyso-TrackerRed在活细胞中的共定位成像；图6是荧光探针在不同pH条件下活细胞的成像。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受下述实施例的限制。实施例1荧光探针的合成（1）将4-溴-1,8-萘二甲酸酐（1mmol）和氨乙基吗啉（1mmol）以乙醇做溶剂，于80℃回流2小时；然后将反应液冷却室温，析出沉淀后，抽滤、烘干，以二氯甲烷为洗脱液过层析柱纯化，得化合物1；（2）将化合物1（1mmol）、羟乙基哌嗪（1mmol）、碳酸钾（0.2mmol）和乙二醇单甲醚（10mL）加入到50mL单口烧瓶中，120℃下搅拌4小时，反应完全，旋干溶剂后将所得固体以二氯甲烷:甲醇=30:1的混合溶剂为洗脱液进行柱层析纯化，得到215mg淡红色产物，即为本专利技术所述检测生物体及细胞内pH荧光探针，产率49%，其1HNMR图谱见图1。实施例2荧光探针对pH的响应以乙醇溶解实施例1中获得的探针化合物，加入PBS缓冲液配制成5μMB-F探针缓冲溶液（含5%乙醇），使pH分别为2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，共17个；然后进行荧光检测（λEx=450nm），计算各体系中荧光强度；通过分析531nm处的荧光强度强度与pH的关系，评估该探针对pH的响应性能（见图2和图3）。图2表明，随着羟胺浓度的增大，溶液的531nm处的荧光强度逐渐增强，而637nm处的荧光强度逐渐减弱。图3表明，分析溶液pH在5.5-8.0范围内，531nm处的荧光强度与pH的线性关系，可用公式Y=336.3-41.1X（R=0.991）表示，Y为荧光强度，X为pH值。实施例3荧光探针对pH的特异性分析准备两种分别是含5%乙醇，pH=7.4和5%乙醇，pH=5.0各21份5mL的5μM的探针B-F缓冲溶液，然后分别向该体系中依次加入50μL浓度为10mM的Hcys、Na2S、Na2SO3、NO、H2O2、HClO4、Cys、GSH、NaNO2、Vc等相关分析物的缓冲溶液。然后进行荧光检测（λEx=450nm）各体系中荧光强度；评估该不同物质对荧光探针溶液的干扰性（见图4）。通过图4可以看出，在溶液pH为5.0或7.4时，加入不同金属离子及其他小分子时，溶液的荧光强度基本不变，这表示检测结果基本不受其他干扰物质的影响。实施例4荧光探针在活细胞中的成像4.1细胞内共定位将HeLa细胞放在培养基（含10%BAS的DMEM培养基）中，放置于条件为37℃、5%CO2和20%O2的培养箱中培养24-48h。用微量进样器吸取实施例1中获得的荧光探针溶液（10μM）和溶酶体定位试剂Lyso-TrackerRed注入含有HeLa细胞的培养基中，继续在培养箱中培养30min。之后用PBS（磷酸盐缓冲溶液）冲洗培养细胞3次，荧光探针λEx=561nm，Lyso-TrackerRed的λEx=本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测溶酶体pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：
【技术特征摘要】
1.一种检测溶酶体pH的荧光探针，其结构式如式（I）所示：式（I）。2.一种如权利要求1所述的荧光探针的制备方法，包括以下步骤：将化合物1和羟乙基哌嗪溶于乙二醇单甲醚，在碳酸钾存在下加热反应，反应结束后分离纯化得产物，即检测溶酶体pH的荧光探针：化合物1。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，化合物1与羟乙基哌嗪的摩...
【专利技术属性】
技术研发人员：林伟英，张楠，董宝利，孔秀琪，王超，宋文辉，
申请(专利权)人：济南大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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