双生病毒复制抑制剂制造技术

本发明专利技术涉及复制抑制剂，其为抑制双生病毒的复制的药物，含有锌指蛋白，该锌指蛋白至少可与双生病毒的茎环区DNA的全长或其一部分特异性结合，且可抑制茎环结构的形成。

Duplicating inhibitor of Gemini virus

The invention relates to a replication inhibitor, which is a drug that inhibits the replication of a Gemini virus and contains a zinc finger protein. The zinc finger protein can specifically bind to the full length or part of the DNA in the stem ring region of the Gemini virus and inhibit the formation of the structure of the stem ring.

【技术实现步骤摘要】
双生病毒复制抑制剂本申请是原案申请日为2011年6月6日、原案申请号201180030222.2(国际申请号为PCT/JP2011/062891)、专利技术名称为“双生病毒复制抑制剂”的专利申请的分案申请。
本专利技术涉及对植物病毒有效的防除感染的手段。更具体地说，涉及针对植物病毒双生病毒的复制抑制剂以及对双生病毒感染具有抗性的植物等。
技术介绍
锌指与螺旋-转角-螺旋基序、亮氨酸拉链基序同为DNA结合基序的一种，其是在氨基末端一侧具有2个半胱氨酸和在羧基末端一侧具有2个组氨酸，在这些残基上配位有锌(Zn)而成的立体结构。锌指对DNA具有非常强的结合力，因此有人利用该基序提出了与DNA牢固结合的人工DNA结合蛋白(以下在本说明书中有时称为“AZP”)，并报道了使用识别密码表(NondegenerateRecognitionCodeTable(非简并识别密码表))设计的AZP，其可识别特定的碱基序列(日本特表2004-519211号公报；Biochemistry,41,7074-7081页,2002)。一个锌指基序可识别3bp或4bp并结合，通过用肽接头连接锌指来调节希望特异性结合的碱基序列的长度。锌指基序的第4号的识别碱基序列是反义链，与下一个锌指基序的第1号的识别碱基序列重叠，因此，N个锌指基序识别3N+1bp的碱基序列并结合(参照图1)。有报道称，使用该AZP可实现对植物DNA病毒感染的防除(J.Virology,79,2614-2619页,2005)。该出版物中报道了在拟南芥中AZP防除植物DNA病毒甜菜严重曲顶病毒(BeetSevereCurlyTopVirus)(BSCTV)感染的效果，该方法采用通过AZP来抑制病毒复制起始所需的复制蛋白(Rep)与复制起点上的Rep结合位点(同向重复序列)结合的手段，是基于复制起点的同向重复序列设计具有比Rep高的DNA结合能力的AZP来抑制病毒复制的方法。但是，在用AZP阻断Rep的同向重复序列的该方法中，复制起点具有病毒特有的碱基序列，因此，为了与各种植物病毒对应，存在必须使用分别不同的AZP的问题。从上述角度出发，人们希望提供用单一的AZP实现对多种植物病毒感染的防除效果的手段。番茄黄化曲叶病是感染番茄的病毒病，通过烟粉虱传播的番茄黄化曲叶病毒(TomatoYellowLeafCurlVirus:TYLCV)感染而发病。番茄黄化曲叶病一旦发病，新叶自叶缘褪色、黄化，呈现曲叶症状，然后叶萎缩，植株全体矮化，生长停止。番茄黄化曲叶病在地中海沿岸、非洲、中近东、亚洲、中南美等地带来严重的灾害。TYLCV存在很多分离株，目前为止在日本国内报道的有TYLCV以色列株(急性型：长崎株和土佐株)以及TYLCV温和株(温和型：静冈株和爱知株)等。TYLCV属于双生病毒科(Geminiviridae)，双生病毒是感染植物、具有1个或2个单链环状DNA的病毒的总称。双生病毒包括马铃薯黄色花叶病毒(Potatoyellowmosaicvirus)和菜豆金色花叶病毒(Beangoldenmosaicvirus)等各种植物病毒，期待的是，如果可以提供以双生病毒中高度保守的碱基序列为靶标的病毒复制抑制手段，则不仅限于TYLCV感染，也可有效地防除多种植物病毒感染。关于具有双生病毒持续抗性的转化植物的制作方法，已知有国际公开WO2004/101798中公开的方法等，但与本专利技术的方法完全不同。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特表2004-519211号公报专利文献2：国际公开WO2004/101798非专利文献非专利文献1：Biochemistry,41,7074-7081页,2002非专利文献2：J.Virology,79,2614-2619页,2005。
技术实现思路
专利技术所要解决的课题本专利技术的课题在于提供对双生病毒有效的防除感染的手段。更具体地说，本专利技术的课题是提供抑制双生病毒复制的药物以及对双生病毒具有抗性的植物等。用于解决课题的手段双生病毒一旦进入到植物内，首先通过植物内源性的因子形成双链环状DNA。接着，来自病毒的复制蛋白(Rep)与位于基因间区(IR)的茎环上游的Rep结合位点结合。Rep是具有多功能的蛋白质，与Rep结合位点结合，在茎环的环部分的9个碱基的序列中加入切口后，与加入了切口的DNA的5’末端共价结合。之后，以－链作为模板，由3’末端开始DNA合成，在合成了1个拷贝的基因组时，通过Rep再一次在新合成的9个碱基的序列中加入切口。同时切出的1个拷贝的基因组份的DNA通过Rep连接，复制单链环状DNA，Rep与新合成的5’末端共价结合。通过该重复来进行双生病毒的复制，Rep以外的复制所必需的材料全部来自植物(参照图2以及，化学と生物,41,311-317页,2003等)。已知Rep只切断单链DNA，为了使Rep切断病毒DNA，病毒DNA必须采取茎环结构。在双生病毒中，已知形成该茎环的碱基序列极为高度保守。通常茎区由9个GC对和2个AT对组成，环区由11个碱基或12个碱基组成，在TT、TTT、TA或ATA之后存在TAATATTAC的碱基序列(参照化学と生物,41,311-317页,2003中313页的图2等)。本专利技术人着眼于该茎环部分，为了提供可普遍抑制属于双生病毒的多种病毒复制的手段而进行了深入研究。结果发现：通过使AZP与茎环部分的DNA特异性结合，使病毒DNA的双链结构稳定，抑制其向茎环结构变化，由此可以抑制只切断单链DNA的Rep对病毒DNA的切断。还确认了该病毒复制抑制作用实际在植物体中发挥作用。本专利技术基于上述认识完成。即，本专利技术提供复制抑制剂，其是针对双生病毒的复制抑制剂，含有锌指蛋白，且可以抑制茎环结构的形成，其中，该锌指蛋白可以与双生病毒的茎环区的全长DNA或选自该全长DNA的1或2处以上的部分DNA特异性结合。该专利技术的优选方案提供：上述复制抑制剂，其含有可与选自双生病毒茎区的全长DNA的1处(1個)的部分DNA结合的单一锌指蛋白；上述复制抑制剂，其含有可与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA结合的单一锌指蛋白；上述复制抑制剂，其中上述锌指蛋白为含有10个锌指结构域的锌指蛋白；上述复制抑制剂，其含有锌指蛋白，该锌指蛋白是通过接头将2个以上可分别与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA结合的锌指蛋白连接而成；上述复制抑制剂，其含有2个锌指蛋白；上述复制抑制剂，其中，2个锌指蛋白为含有3个锌指结构域的锌指蛋白和含有6个锌指结构域的锌指蛋白。本专利技术也提供编码上述锌指蛋白的核酸，以及是针对双生病毒的复制抑制剂的、含有编码上述锌指蛋白的核酸的复制抑制剂。根据上述专利技术的优选方案，提供：上述复制抑制剂，其中，双生病毒为属于菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)的病毒；上述复制抑制剂，其中，双生病毒为番茄黄化曲叶病毒。从另一角度出发，本专利技术提供：抗双生病毒剂，其含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸；针对双生病毒的感染预防剂，其含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸；用于防除双生病毒感染的农药，该农药含有上述锌指蛋白或编码上述锌指蛋白的核酸。进一步从其它角度出发，本专利技术提供：预防植物的双生病毒感染的方法，该方法包括对植物本文档来自技高网...

【技术保护点】
复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白，所述锌指蛋白是通过接头将2个以上可分别与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA特异性结合的锌指蛋白连接而成，且可以抑制茎环结构的形成，该锌指蛋白还与连接至茎环区DNA的上游和/或下游的DNA特异性结合，且具有SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2010.06.07 JP 2010-1296821.复制抑制剂，所述复制抑制剂含有锌指蛋白，所述锌指蛋白是通过接头将2个以上可分别与选自双生病毒茎区的全长DNA的2处以上的部分DNA特异性结合的锌指蛋白连接而成，且可以抑制茎环结构的形成，该锌指蛋白还与连接至茎环区DNA的上游和/或下游的DNA特异性结合，且具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。2.权利要求1所述的复制抑制剂，在从茎区的全长DNA中选择2处以上的部分DNA时，选择不含有在作为靶标的多种双生病毒的茎区中为非共有序列的部分DNA，且选择位于该非共有序列的上游和下游的共有序列的DNA作为部分DNA。3.权利要求1所述的复制抑制剂，其中，2个锌指蛋白为含有3个锌指结构域的锌指蛋白以及含有6个锌指结构域的锌指蛋白。4.权利要求1所述的复制抑制剂，其中，接头为肽接头。5.权利要求1-4中任一项所述的复制抑制剂，其中，双生病毒为属于菜豆金色花叶病毒属的病毒。6.权利要求5所述的复制抑制剂，其中，双生病毒为番茄黄化曲叶病毒。7.编码权利要求1-6中任一项所述的锌指蛋白的核酸。8.植物转化用的重组载体，所述重组载体含有权利要求7的核酸。...

【专利技术属性】
技术研发人员：世良贵史，
申请(专利权)人：世良贵史，
类型：发明
国别省市：日本,JP