一种荧光探针 Cou-Bu 及其制备和在臭氧检测中的应用制造技术

一种荧光探针Cou‑Bu及其制备和在臭氧检测中的应用。本发明专利技术提供了一种可用于选择性检测臭氧分子的荧光探针。主要合成方法如下：7‑氨基‑4‑甲基香豆素与三光气反应得到酰氯，生成的产物又和3‑丁烯‑1‑醇发生酯化反应，最终生成结构为

A fluorescent probe Cou-Bu and its preparation and application in ozone detection

A fluorescent probe Cou Bu and its preparation and application in ozone detection. The invention provides a fluorescent probe which can be used for selectively detecting ozone molecules. The main synthetic methods are as follows: 7 the reaction of three methamyl coumarin and three phosgene is obtained by the reaction of acyl chloride, and the product is esterified with 3 polybutylene 1 alcohol, and the final structure is formed.

【技术实现步骤摘要】
一种荧光探针Cou-Bu及其制备和在臭氧检测中的应用
本专利技术涉及荧光探针领域，具体涉及一种可用于选择性检测臭氧分子的荧光探针。以7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光母体，通过先与三光气反应得到酰氯，而后又和3-丁烯-1-醇发生酯化反应制得。与臭氧作用后，利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测活细胞中的臭氧。
技术介绍
臭氧在生命体系和人类疾病中产生影响的证据已经逐日增多，较为严峻的便是臭氧会引发生物体内自由基的形成。比如：由于肺细胞和各种上皮细胞对臭氧非常敏感，因此臭氧极易使这些细胞内环境紊乱，产生较多自由基，进而发生癌变或凋亡；动脉粥样硬化患者的病变处也检测到臭氧存在的信号，胆固醇臭氧分解产生的类固醇被认为是动脉粥样硬化发病机制的关键物质。另外由于臭氧的强氧化性，在一些氨基酸(如：组氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、色氨酸)存在的条件下，中性粒细胞能够产生臭氧用于杀死外源微生物以达到杀菌消炎的功效。近几年来，一些用于检测活细胞中臭氧的荧光探针不断出现，活细胞中臭氧的检测也逐步取得一些进展。但是其水平调控的内在机制并不清楚。因此，开发能够实时检测细胞中臭氧的探针具有重要意义。荧光探针是有效检测生命体内臭氧的手段之一，相比吸光度法具有检测灵敏的优势。一个具有应用前景的荧光探针应具有作用前后荧光变化明显、对目标分子响应快、选择性好、合成简单等优点。目前应用于检测细胞内臭氧的方法主要集中于外源臭氧的检测，检测细胞中内源臭氧的重要性并未受到太多重视，然而内源臭氧的检测对于研究相关病理机制意义重大。另外，检测臭氧的荧光探针虽然有一些新的发展，但是选择性好的荧光探针仍寥寥无几。尤其生命体系内环境是相当复杂的，各种不同的反应机制代谢出不同的活性氧，这些活性氧对于臭氧的检测通常会有很多干扰，开发对其有选择性的探针具有很大挑战性。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供了一种可用于选择性检测细胞内臭氧的荧光探针，此探针可以在生理条件下选择性地与臭氧作用，作用后荧光显著增强。本专利技术采用如下技术方案：以7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光母体，通过先与三光气反应得到酰氯，而后又和3-丁烯-1-醇发生酯化反应制得。利用反应物与产物的荧光差别实现选择性地检测臭氧，尤其是可以应用于检测活细胞中的臭氧。合成的探针化合物的结构用代号Cou-Bu表示。所述荧光探针的结构式Ⅰ如下。所述的荧光探针的具体制备步骤如下，1)三光气和催化剂三乙胺于溶剂中搅拌反应1h后，加入7-氨基-4-甲基香豆素，继续反应1h；2)步骤1)中得到的产物中，加入3-丁烯-1-醇，80℃下搅拌反应10h后，真空下70℃加热蒸干；3)步骤2)中得到的产物经硅胶柱层析纯化(用石油醚和乙酸乙酯做洗脱剂)得最终产物Cou-Bu(淡黄色固体)。所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的三乙胺作为催化剂的加入量为200微升，三光气与7-氨基-4-甲基香豆素的加入量为1:3-6；步骤2)中3-丁烯-1醇的加入量为第一步中7-氨基-4-甲基香豆素加入量的1.2-1.5倍；步骤3)中色谱法的rf为0.1，所述的石油醚与乙酸乙酯的比例为2:1。。所述的制备方法，其特征在于：所述步骤1)和步骤2)中，所用的溶剂为无水四氢呋喃；所述的步骤1)—3)中搅拌的方式为磁力搅拌。所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针可以用于臭氧分子的定性或定量检测。所述的荧光探针的应用，其特征在于：所述的荧光探针应用于检测臭氧时，生成具有结构II的化合物，从而导致荧光变化；结构名称：7-氨基-4-甲基香豆素。所述的荧光探针的应用，其特征在于：在定量检测臭氧中的应用，所述的荧光探针与臭氧水作用后，440nm和395nm两处的荧光强度比值F440nm/F395nm正比于臭氧水的浓度。所述的荧光探针的应用，其特征在于，所述的荧光探针可用于细胞内臭氧分子的检测，实现细胞内臭氧的荧光成像。本专利技术的有益效果：该化合物在臭氧存在下荧光发生显著改变，可用于高选择性、高灵敏性地检臭氧。尤其是，该化合物可用于细胞内中的臭氧检测，这对于深入研究臭氧在生物体内生理和病理过程的动力学机理具有重要意义。附图说明图1实施例1中提供的荧光探针Cou-Bu的合成路线图；图2本专利技术提供的荧光探针Cou-Bu检测臭氧的原理示意图；图3实施例1中合成的探针Cou-Bu的1HNMR(a)，13CNMR(b),HRMS谱图(c)；图4实施例2中荧光探针Cou-Bu水溶液和与臭氧反应后的产物的紫外可见吸收光谱(a)、发射光谱(b),荧光探针Cou-Bu与臭氧反应的动力学示意图(c)；图5实施例3中荧光探针Cou-Bu对臭氧的选择性示意图；(1-10:NaClO,H2O2,1O2,HNO3,Na2S2O3,NaSO3,ONOO-,t-BuOOH,O3水溶液1-9:50Mm,10:30uM)图6实施例4中荧光探针Cou-Bu对臭氧定量检测示意图；a为荧光探针Cou-Bu对臭氧定量检测示意图(b为不同形状表示反应中加入的不同浓度的臭氧)图7实施例5中荧光探针Cou-Bu的试纸定性实验示意图之一；荧光探针Cou-Bu的试纸定性实验示意图1，从左至右探针浓度：50uM-5mM、10uM-40uM、0uM图8实施例6中荧光探针Cou-Bu的试纸定性实验示意图之二；荧光探针Cou-Bu的试纸定性实验示意图2，从左至右臭氧浓度：0uM、10uM-50uM、50uM-100mM图9实施例7中荧光探针Cou-Bu在A549细胞中成像示意图。荧光探针Cou-Bu在A549细胞中成像示意图(图A加入10uM探针孵育20min后的荧光成像，图B为A的明视场图，图C为A的基础上加入6uM的臭氧孵育30min后的荧光成像图，图D为图C的明视场图)图10实施例8中荧光探针Cou-Bu在RAW264.7细胞中成像示意图。荧光探针Cou-Bu在RAW264.7细胞中成像示意图(图A为入10uM探针孵育20min后的荧光成像，图B为加入PMA刺激20min后的荧光成像，图C为在A的基础上加入PMA孵育20min后的荧光成像，图D为A、B、C的明视场图)。具体实施方式实施例用于进一步说明本专利技术，但本专利技术不限于实施例。实施例1(探针Cou-Bu的合成)：如图1所示，Cou-Bu的合成：50mL三口烧瓶真空/氮气置换三次，加入0.22g三光气、20mL的干燥四氢呋喃和200uL的干燥三乙胺，冰浴条件(0℃)下搅拌反应1h。1h后，加入0.35g7-氨基4-甲基香豆素搅拌，加热80℃反应1h。1h后加入220ul3-丁烯-1-醇。将所得产物经硅胶柱层析纯化(用石油醚和乙酸乙酯做洗脱剂)得最终产物Cou-Bu(淡黄色固体)。1HNMR(400MHz,Chloroform-d)δ(ppm):δ＝9.88(s,1H),7.52(s,1H),7.42(d,1H,),7.36(d,1H,),6.84(s,1H),5.82(m,1H,),5.13(d,1H,),4.88(d,1H,),4.26(t,2H,),2.47(s,3H),2.42(m,2H,).13CNMR(Chloroform-d,100MHz)δ(ppm):161.16,154.46,153.00,152.30,141.54,1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光探针Cou‑Bu，其特征在于：所述的荧光探针的结构为结构I所示，

【技术特征摘要】
1.一种荧光探针Cou-Bu，其特征在于：所述的荧光探针的结构为结构I所示，结构代号：Cou-Bu。2.一种权利要求1所述的荧光探针Cou-Bu的制备，其特征在于：所述的荧光探针为以7-氨基-4-甲基香豆素作为荧光母体，通过先与三光气反应得到酰氯，而后又和3-丁烯-1-醇发生酯化反应制得。3.根据权利要求2所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：具体制备步骤如下，1)三光气和催化剂三乙胺于溶剂中搅拌反应1h以上，加入7-氨基-4-甲基香豆素0.35克，继续反应1h以上；2)步骤1)中得到的产物中，加入3-丁烯-1-醇，70-80℃下搅拌反应10h以上，真空下50-70℃减压蒸馏加热蒸干；3)步骤2)中得到的产物经硅胶柱层析纯化(用石油醚和乙酸乙酯做洗脱剂)得最终产物Cou-Bu(淡黄色固体)。4.根据权利要求3所述的荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤1)中所述的三乙胺作为催化剂的加入量为200微升，三光气与0.35克7-氨基-4-甲基香豆素的加入量为1:3-6；步骤2)中3-丁烯-1醇的加入量为第一步中7-氨基-4-甲基香豆素加入量...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩克利，李春燕，李鹏，贾燕，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21