本发明专利技术涉及赖氨酸脱羧酶的突变型的生成方法和突变型的特性、对上述赖氨酸脱羧酶的突变型进行编码的基因及利用这些的尸胺的生产方法。本发明专利技术提供通过蛋白质工程变异的改善的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶。并且，本发明专利技术的突变型赖氨酸脱羧酶在生产尸胺时，增加活性及pH稳定性、热稳定性来提供因收率及生产性增加而带来的生产费用的降低。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及其应用
本专利技术涉及通过蛋白质工程酶变异的赖氨酸脱羧酶的突变型开发方法及所生成的突变型的特性分析、利用上述突变型酶进行的生物转化反应。
技术介绍
近来，在石油资源不断被耗尽时，正在积极进行利用非石油资源的生物材料合成高分子前体的研究。尤其，两个末端具有两个胺基，并且由五个碳组成的尸胺(cadaverine；1，5-diaminopentane)不仅可用作高分子前体，而且可广泛用于化学工业领域。例如，聚酰胺、聚氨酯、螯合剂等。近年来，正在积极进行利用赖氨酸合成尸胺的研究，或者利用与赖氨酸相比费用低廉的葡萄糖或淀粉中的微生物细胞的生物转化功能大量生产尸胺的研究。像这样，以生物转化技术通过宿主的基因突变来大量生产尸胺的方法很多，但是赖氨酸可通过使用如淀粉或葡萄糖等起始材料的生物转化过程的多个步骤来合成，这种赖氨酸可通过多种反应转化为其他化合物，因此被用作主要的起始材料。其一个例子为脱羧反应，并且可通过赖氨酸脱羧酶反应来合成尸胺。在微生物中利用葡萄糖生产赖氨酸的技术可在谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)宿主中以约120g/L的水平生产，并且正在进行商业化大量生产。因此，需要一种能够可将这种高浓度的赖氨酸作为基质来转化为细胞中的多种化合物的技术，或者在试管中能够以一步(one-step)反应更有效地转化为尸胺的技术。众所周知，谷氨酸棒状杆菌中不包含赖氨酸脱羧酶，但是在多种来源的微生物中包含赖氨酸脱羧酶。其中，尤其，利用磷酸吡哆醛(PLP，pyridoxal-5'-phosphate)辅酶的大肠杆菌(Escherichiacoli)来源的赖氨酸脱羧酶的反应性高。在大肠杆菌中，存在两种赖氨酸脱羧酶，上述赖氨酸脱羧酶包含在细胞生长过程中连续表达的LdcC赖氨酸脱羧酶和仅在弱酸性的pH的条件下诱导表达的LdcI赖氨酸脱羧酶。加拿大多伦多大学的Houry研究小组已经揭示了大肠杆菌来源的LdcI赖氨酸脱羧酶的结构，发现上述酶呈现由10个单位组成的十聚体(decamer)形态。可通过赖氨酸脱羧酶所显示的结构及多个氨基酸残基的变异来预测影响酶活性的重要的要素及反应的机制。在活性比较高的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶LdcI的情况下，当利用于高浓度的工业反应时，存在几个缺点。在弱酸性的条件(pH5.6)下的活性高，但是在中性或碱性条件下，存在快速丧失活性的缺点，因此为了进行高浓度及长时间的重复反应，需要增加LdcI酶的pH及热稳定性，并且需要更高的酶活性。基于这种理由，通过酶的结构性研究来提高整个pH的酶反应性，通过开发热稳定性及pH稳定性得到改善的突变型来应用于高浓度及连续的赖氨酸生物转化反应中。现有技术文献专利文献专利文献1：韩国公开专利10-2012-0021491专利文献2：韩国公开专利10-2014-0012099非专利文献非专利文献：细菌的酸性压力及其反应：可诱导的赖氨酸脱羧酶的结构，EMBOJ.2011Mar2；30(5)：931-44非专利文献：通过pH变化观察N-末端结构来提高大肠杆菌来源的谷氨酸脱羧酶B的热稳定性，JBiotechnol.2014Mar20；174：22-8
技术实现思路
技术问题在现有技术的情况下，在利用赖氨酸生成尸胺的过程中，可在大肠杆菌中过表达，在大多数情况下，使用高活性的大肠杆菌来源的LdcI赖氨酸脱羧酶。并且，已经进行了如下的研究，即，虽然活性低，但是LdcC也与LdcI一同表达，从而将其一同用于生产尸胺等。在先前的专利和研究中，为了增加尸胺的生产，在宿主细胞中使用调节酶的表达或者过表达反向转运体，使赖氨酸和尸胺易于释放到细胞外，或者阻断分解尸胺的途径的方法等改变除酶以外的生产途径的其他部分，从而进行了使利用赖氨酸生产的尸胺最大化的间接基因突变。这些研究可对利用细胞的赖氨酸生物转化有用，但是利用于细胞外的试管或反应器中的生物转化反应是有限的。为了利用于如上所述的细胞外的试管或反应器中的生物转化反应，直接提高赖氨酸脱羧酶的稳定性及酶活性的方法有效。为此，进行了以理解反应的机制并通过对活性重要的多个残基的变异的方式显著提高活性的研究。然而，迄今为止，尚未报道通过向赖氨酸脱羧酶自身提供直接的变异来克服大肠杆菌的LdcI及LdcC酶具有的结构及稳定性的缺点，从而增加活性并利用于高浓度及长时间连续反应等的研究。在将赖氨酸生物转化为尸胺的反应中，首先要考虑反应的pH。在反应的机制中，由于去除赖氨酸的羧基并消耗反应液的氢离子，随着反应的进行，反应液的pH变得更碱性，因此当酶对pH敏感时，失去很多活性，并且为了进行高浓度和长时间反应，酶的活性应保持在宽的pH区域内。在大肠杆菌赖氨酸脱羧酶的情况下，已经报道了两种具有不同特征的LdcC和LdcI。与LdcI相比，LdcC为在细胞生长过程中始终表达的酶，具有相对较低的活性及表达程度，但在整个宽的pH区域内保持其活性。然而，LdcI在pH5.6附近呈现高活性，当反应液的pH为7.0以上时，其活性急剧降低并且在碱性条件下观察到活性显著地降低。当然，与LdcC相比，由于LdcI属于非活性高的酶，因此有利于高浓度反应，但是为了进行工业高浓度及长时间连续使用反应，LdcI需要pH稳定性、热稳定性及更高的酶活性。解决问题的方案本专利技术提供通过赖氨酸脱羧酶的蛋白质工程变异的突变型生成方法、所生成的突变型的检索及对这些突变型进行编码的基因序列信息。并且，本专利技术提供分析这些突变型的特性并利用这些生成尸胺的方法。即，本专利技术使用通过蛋白质工程变异被改善的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶来适用于尸胺生产反应。并且，本专利技术提供用于生成赖氨酸脱羧酶突变型的逻辑预测方法，从而选择作为蛋白质的目的的部分，利用蛋白质的序列、结构、功能及计算机程序选择特定氨基酸的残基来进行变异。并且，本专利技术提供包含改变的赖氨酸脱羧酶的氨基酸残基的序列的赖氨酸脱羧酶基因、包含其的重组DNA载体及利用重组DNA载体转化的宿主细胞。专利技术的效果本专利技术可通过使用催化功能得到提高的赖氨酸脱羧酶的突变型来增加尸胺生产性及生产效率，从而降低生产成本。并且，本专利技术增加在pH4至pH10下的酶的pH稳定性及在20℃至70℃的温度下的酶的热稳定性，以便提高在尸胺的大量生产中的赖氨酸脱羧酶的可再利用性并降低酶的生产成本。并且，通过大量生产上述尸胺来用作各种高分子前体、食品、化学添加剂等，可通过本专利技术的突变型生成方法来适用于其他脱羧酶，尤其适用于使用磷酸吡哆醛(PLP)辅酶的脱羧酶。附图说明图1示出通过使用本专利技术的L-赖氨酸作为基质来利用赖氨酸脱羧酶的尸胺合成示意图。图2示出由序列15表示的野生型(WT)赖氨酸脱羧酶LdcI的单个氨基酸及其突变型的相对比活度(relativespecificactivity)。图3示出本专利技术的赖氨酸脱羧酶的单个氨基酸的变化及这些的组合突变型的蛋白质的熔点温度(Tm)。图4为将被纯化的野生型赖氨酸脱羧酶LdcI和被纯化的LdcI的第14位的苯丙氨酸(phenylalanine)被酪氨酸取代的突变型浸渍于多种pH溶液(pH4.4、5.6、6.6、7.6、8.5或9.6)后对还存在多少活性进行比较的图。所有的值表示相对比活度。图5为将被纯化的野本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种赖氨酸脱羧酶的变异体，由下述碱基序列中的一种序列表示，其特征在于：序列1的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(F14Y)；序列4的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代(L7M/N8G)；序列5的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(L7M/N8G/F14Y)；序列6的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(F14C/K44C)；序列7的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(L7M/N8G/F14C/K44C)。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.06 KR 10-2015-01111151.一种赖氨酸脱羧酶的变异体，由下述碱基序列中的一种序列表示，其特征在于：序列1的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(F14Y)；序列4的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代(L7M/N8G)；序列5的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，作为第14位的氨基酸的苯丙氨酸被酪氨酸取代(L7M/N8G/F14Y)；序列6的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(F14C/K44C)；序列7的氨基酸序列，在序列15(LdcI)的氨基酸序列中，作为第7位的氨基酸的亮氨酸被蛋氨酸取代，作为第8位的氨基酸的天冬酰胺被甘氨酸取代，第14位的苯丙氨酸被半胱氨酸取代，作为第44位的氨基酸的赖氨酸被半胱氨酸取代(L7M/N8G/F14C/K44C)。2....
【专利技术属性】
技术研发人员：金秉祺，洪银姈，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国,KR
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