一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，该技术方案首先通过特异的荧光引物的设计和筛选，FQ‑PCR反应体系和条件的优化，经特异性试验、灵敏度试验、敏感性性试验的验证，建立快速、灵敏、特异的鉴别检测方法，并应用于临床检测。然后以鸡的ACTB基因为内参，建立ACTB FQ‑PCR反应体系，与aMPV TaqMan‑MGB PCR条件进行兼容优化，建立aMPV核酸的相对定量FQ‑PCR方法。相对于现有技术中禽偏肺病毒的检测方法而言，本发明专利技术领密度更高、同时能实现不同血清型的分型鉴定，具有良好的应用前景。

A fluorescent quantitative detection kit for identification of avian partial lung virus

The present invention provides a fluorescent quantitative detection kit for identification of avian biased lung virus (fowl). First, the design and screening of specific fluorescent primers, the optimization of the FQ PCR reaction system and conditions, and the establishment of rapid, sensitive and specific test by specificity test, sensitivity test and sensitivity test. The method is applied to clinical detection. Then, based on the ACTB base of chicken, the ACTB FQ PCR reaction system was established, and the aMPV TaqMan MGB PCR conditions were compatible and optimized, and the relative quantitative FQ PCR method of aMPV nucleic acid was established. Compared with the detection methods of avian partial lung virus (fowl) in the existing technology, the invention has higher collar density and can realize the identification of different serotypes at the same time, and has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒
本专利技术涉及基因工程
，具体涉及一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒。
技术介绍
禽偏肺病是由禽偏肺病毒(Avianmetapneumovirus，aMPV)引起家禽呼吸道感染的急性高度传染性疾病，禽偏肺病毒又称为火鸡鼻气管炎病毒(Turkeyrhinotracheitisvirus，TRTV)或禽肺炎病毒(Avianpneumovirus，APV)。主要通过空气传播，禽偏肺病对世界范围内的养禽业造成严重的经济损失。目前我国是世界上排名第一的养鸡大国，鸡的饲养量96亿只，每年因各类禽病带来的死亡率高达20％～25％，损失几百亿人民币。因此，研制特异、灵敏、简便的鉴别检测试剂盒是我国当前防控疫病的迫切需求。aMPV现有的常规诊断方法如免疫荧光、病毒分离、虽有各自的优点，但均存在敏感性、特异性及时耗等方面的不足，这给禽偏肺病的低成本快速净化措施的制定带来了巨大难度。因此，建立一种快速、敏感、特异地鉴别禽偏肺病，规避干扰的分子生物学诊断方法势在必行。同时，Real-timeRT-PCR技术以其独有的准确定性与定量优势备受研究者青睐，相比其他半定量方法，实现了真正意义上的定量，相对定量技术更使得真正意义上的核酸动态研究成为可能。根据G基因核苷酸序列的差异性，aMPV被划分为A、B、C、D四个亚型，其G蛋白长度依次为391、414、252和389个氨基酸，目前的血清学检测技术还不能提供禽偏肺病毒的分型鉴定。在应用Real-timeRT-PCR技术检测的时候需要考虑的是设计亚型特异性引物。TaqMan探针全称TaqManMinorGrooveBinderprobe，与普通TaqMan水解探针不同之处在于探针的3'端连接一个不发荧光的Q基团和一个特殊的小沟结合子(MinorGrooveBinderprobe)，这种特殊的设计赋予了MGB探针三大优势一是显著提高Tm值，这样可以减少探针设计长度，对AT富含区的探针设计更为有利；二是可以降低背景荧光信号，提高信噪比，使实验结果更精确，分辨率更高；三是提高了探针与互补模板的结合特异性，即使一个碱基的不匹配都能精确分辨。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，以解决现有技术中缺乏一种此类试剂盒的技术问题。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的血清学检测方法无法实现禽偏肺病毒不同亚型的分型鉴定。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的检测方法灵敏度低。本专利技术要解决的又一技术问题是现有技术中针对禽偏肺病毒的检测方法难以实现定量检测。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，所述试剂盒包括五条探针，分别为：序列如SEQIDNO.3所示的、用于检测禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.6所示的、用于检测禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.9所示的、用于检测禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.12所示的、用于检测禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性探针。作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.15所示的、用于检测鸡ACTB基因的特异性探针；其中所述鸡ACTB基因是所述试剂盒中的内参基因。作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.1所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.2所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.4所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物；还包括序列如SEQIDNO.5所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.7所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.8所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。作为优选，所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.10所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.11所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。作为优选，所述试剂盒还包括序列SEQIDNO.13所示的针对鸡看家基因的特异性上游引物；还包括序列SEQIDNO.14所示的针对鸡看家基因的特异性下游引物。作为优选，所述试剂盒包括针对鸡ACTB基因的第一反应体系，所述第一反应体系包括以下成分：10×PCRBuffer5μL，0.07μM的dNTPMixture1.4μL，2U/μL的SSIII反转录酶0.5μL，0.05U/μL的TaqHSDNA聚合酶0.5μL，浓度为0.4μM、序列如SEQIDNO.13所示的上游引物2μL，浓度为0.6μM、序列如SEQIDNO.14所示的下游引物3μL，浓度为0.08μM、序列如SEQIDNO.15所示的探针0.8μL，RNA溶液10μL，DEPC水26.8μL。作为优选，所述试剂盒包括针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因、禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的第二反应体系，所述第二反应体系包括以下成分：10×PCRBuffer5μL，0.08μM的dNTPMixture1.6μL，2U/μL的SSIII反转录酶0.5μL，0.05U/μL的TaqHSDNA聚合酶0.5μL，浓度为0.6μM、序列分别如SEQIDNO.1、SEQIDNO.4、SEQIDNO.7、SEQIDNO.10所示的混合上游引物3μL，浓度为0.6μM、序列分别如SEQIDNO.2、SEQIDNO.5、SEQIDNO.8、SEQIDNO.11所示的混合下游引物3μL，浓度为0.16μM、序列分别如SEQIDNO.3、SEQIDNO.6、SEQIDNO.9、SEQIDNO.12所示的混合探针1.6μL，RNA溶液10μL，DEPC水24.8μL。作为优选，所述试剂盒的PCR反应条件为：50℃反转录20min，94℃预变性2min，88℃变性8s，60℃退火、延伸35s，共40个循环，而后收集荧光。本专利技术提供了一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，该技术方案首先通过特异的荧光引物的设计和筛选，FQ-PCR反应体系和条件的优化，经特异性试验、灵敏度试验、敏感性、重复性、稳定性及符合性试验的验证，建立快速、灵敏、特异的鉴别检测方法，并应用于临床检测。然后以鸡的ACTB基因为内参，建立ACTBFQ-PCR反应体系，与aMPVTaqMan-MGBPCR条件进行兼容优化，建立aMPV核酸的相对定量FQ-PCR方法。本专利技术通过反应体系和循环条件的系统优化，建立一套相对完善的aMPV荧光定量PCR检测方法，并能应用于临床检测，为禽偏肺病的控制和净化提供有力的技术手段。此外，本专利技术以上述aMPV荧光定量PCR体系为基础，建立一套基于鸡ACTB基因的ACTBFQ-PCR体系，并将两个体系进行反应条件的兼本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括五条探针，分别为：序列如SEQ ID NO.3所示的、用于检测禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.6所示的、用于检测禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.9所示的、用于检测禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQ ID NO.12所示的、用于检测禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性探针。

【技术特征摘要】
1.一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括五条探针，分别为：序列如SEQIDNO.3所示的、用于检测禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.6所示的、用于检测禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.9所示的、用于检测禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性探针；序列如SEQIDNO.12所示的、用于检测禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性探针。2.根据权利要求1所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.15所示的、用于检测鸡ACTB基因的特异性探针；其中所述鸡ACTB基因是所述试剂盒中的内参基因。3.根据权利要求2所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.1所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.2所示的、针对禽偏肺病毒A亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。4.根据权利要求3所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.4所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物；还包括序列如SEQIDNO.5所示的、针对禽偏肺病毒B亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。5.根据权利要求4所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.7所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.8所示的、针对禽偏肺病毒C亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。6.根据权利要求5所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括序列如SEQIDNO.10所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性上游引物，还包括序列如SEQIDNO.11所示的、针对禽偏肺病毒D亚型G蛋白表达基因的特异性下游引物。7.根据权利要求6所述的一种针对禽偏肺病毒分型鉴定的荧光定量检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒还...

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，阎旭，李亚杰，付旭彬，郁宏伟，刘海霞，王艳晓，
申请(专利权)人：天津瑞普生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：天津,12