一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用技术

本发明专利技术提供了一种具有背景干扰降低、样品穿透性强、选择性好、灵敏度高和成像分辨率好等优点的荧光“关‑开”型近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用。所述荧光探针以一种含多个双键的近红外荧光母核作为荧光团，以2,4‑二硝基苯磺酰胺部分作为猝灭单元使其荧光猝灭；实际检测中在半胱氨酸存在下，半胱氨酸的巯基对缺电子芳环发生亲核取代反应，磺酰胺键裂解，荧光猝灭剂解离，使得基于分子内电荷转移(ICT)过程的本身无荧光或弱荧光的探针分子释放出荧光母核，荧光增强或打开，产生选择性识别半胱氨酸荧光信号，从而达到对半胱氨酸(Cys)选择性识别和分析检测的目的。

Near infrared detection of cysteine fluorescent probe, preparation method and application thereof

The invention provides a fluorescent probe, the preparation method and the application of a fluorescence probe for detecting cysteine with close infrared detection, which has the advantages of low background interference, strong sample penetration, good selectivity, high sensitivity and good imaging resolution. In the presence of cysteine, the sulfhydryl group of cysteine in the presence of cysteine in the presence of cysteine in the presence of cysteine in the presence of cysteine in the presence of cysteine in the presence of a cysteine in the presence of 2,4, the sulfsulfonamide bond cracking, and fluorescence quenching. The release of the extinguishing agent makes the probe molecules free from fluorescence or weak fluorescence based on the intramolecular charge transfer (ICT) process to release the fluorescent parent nuclei, enhance or open the fluorescence, and produce selective identification of cysteine fluorescence signals, thus achieving the purpose of selective identification and analysis of cysteine (Cys).

【技术实现步骤摘要】
一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用
本专利技术涉及化学分析检测
，具体涉及一种荧光“关-开”型近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用。
技术介绍
生物体内存在着多种重要的小分子巯基化合物，而半胱氨酸(Cys)是唯一含巯基(-SH)的天然必需氨基酸，是合成蛋白质的重要组分。半胱氨酸在生物体内的含量与许多生理疾病有着密切的联系，如阿尔兹海默病、心血管疾病等。因此，可以把半胱氨酸的含量高低作为这类疾病诊断的依据之一，同时，详尽认识半胱氨酸(Cys)的产生、分布及水平波动对细胞活性、机体生理和病理等研究有着重要的科学意义(吕建政.细胞内小分子巯基化合物检测的近红外荧光探针[D].山东师范大学,2014.)。目前，应用于检测半胱氨酸的方法主要有高效液相色谱法、质谱法、毛细管电泳法、荧光检测法和电化学检测法等，荧光成像作为一种直观、原位的可视化观测技术在小分子检测方面得到了广泛应用，但是由于生物体及组织细胞中的某些成分，如胆红素、还原性烟酰胺腺嘌呤二核苷酸等会被激发产生自发荧光，与此同时生物样本的散射光强度大，严重干扰荧光检测及成像。由于细胞和组织的自发荧光在近红外波段最小，因此在检测复杂生物系统时，近红外荧光探针能提供更高的特异性和灵敏度，对细胞损伤小且具有更低的背景干扰。同时，由于光波在近红外区段的组织样品穿透性强，因此近红外荧光探针尤其适合体内荧光成像(活体成像)这一近几年迅速发展的新兴领域。目前对半胱氨酸(Cys)检测的探针多集中于可见光区或依赖灵敏度低的紫外-可见吸收法检测，甚至不能有效区分半胱氨酸和高半胱氨酸(如中国专利CN105693600A，CN105820810A，CN104447421A，Anal.Chem.,2016,88(14),pp7178–7182)，因其荧光发射和UV-vis吸收波长处在相对较短的波长区域，对生物成像应用有严重的限制，但是高灵敏度，特异性和专一性检测半胱氨酸(Cys)的近红外小分子荧光探针却鲜有报道。
技术实现思路
为了解决现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种具有背景干扰降低、样品穿透性强、选择性好、灵敏度高和成像分辨率好等优点的荧光“关-开”型近红外检测半胱氨酸的荧光探针、其制备方法及应用。本专利技术的目的是提供一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针。本专利技术的再一目的是提供所述荧光探针的制备方法。本专利技术的再一目的是提供所述荧光探针的应用。一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针，所述荧光探针的结构为：所述荧光探针以一种含多个双键的近红外荧光母核作为荧光团，以2,4-二硝基苯磺酰胺部分作为猝灭单元使其荧光猝灭；实际检测中在半胱氨酸存在下，半胱氨酸的巯基对缺电子芳环发生亲核取代反应，磺酰胺键裂解，荧光猝灭剂解离，使得基于分子内电荷转移(ICT)过程的本身无荧光或弱荧光的探针分子释放出荧光母核，荧光增强或打开，产生选择性识别半胱氨酸荧光信号，从而达到对半胱氨酸(Cys)选择性识别和分析检测的目的。本专利技术还提供了所述荧光探针的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：步骤一、化合物4-哌嗪-1-苯甲醛的合成a.在反应瓶中加入哌嗪、水、乙二醇单甲醚，将对氟苯甲醛溶于乙二醇单甲醚并置于漏斗中，室温搅拌下缓慢加入反应瓶中，滴加完毕后，回流搅拌反应3-5小时；b.将步骤a中的反应液冷却至室温，再将反应液倒入水中，过滤，然后将滤饼中加入水中，加入盐酸溶液，过滤除去不溶物，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至10，使用二氯甲烷(DCM)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，石油醚重结晶，过滤，真空干燥得4-哌嗪-1-苯甲醛；步骤二、化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯基)环己-2-烯-1-亚基)丙二腈的合成Ⅰ.向反应瓶中加入4-哌嗪-1-苯甲醛、2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、乙醇和催化量的哌啶，搅拌回流反应至完全；Ⅱ.将步骤Ⅰ中的反应液冷却至室温，过滤，滤饼用乙醇洗涤，石油醚洗涤，真空干燥；步骤三、探针(E)-2-(3-(4-(4-((2,4-二硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈的合成A.惰性气体保护下，向反应瓶中加入(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯基)环己-2-烯-1-亚基)丙二腈，加入无水二氯甲烷，冷至0℃，再加入2,4-二硝基苯磺酰氯和干燥重蒸的三乙胺，搅拌反应，并自然升温至室温；B.将步骤A中的反应液减压浓缩除去溶剂二氯甲烷，柱分离得目标探针分子。优选的，步骤b中，盐酸溶液的浓度为10％，氢氧化钠溶液的浓度为20％。优选的，所述反应瓶为圆底烧瓶。优选的，步骤a中哌嗪和对氟苯甲醛摩尔比为3-4：1。优选的，步骤Ⅰ中4-哌嗪-1-苯甲醛和2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈的摩尔比为1:1-1.05。优选的，步骤A中2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈和2,4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1.05。本专利技术还提供了所述荧光探针检测半胱氨酸的用途。进一步的，所述荧光探针在细胞内半胱氨酸荧光成像中的用途。利用所述荧光探针，使用裸眼或荧光检半胱氨酸。所述荧光探针的具体使用方式为：将所述荧光探针用二甲基亚砜(DMSO)溶解，探针分子在磷酸缓冲液(PBS,10mM，pH＝8)中时其最大紫外吸收波长在450nm,加入半胱氨酸(Cys)后在37–C反应2小时，反应液在450nm处的吸收峰明显增强，随着半胱氨酸(Cys)浓度的增高，吸收峰逐渐上升；而且，探针分子在磷酸缓冲液(PBS,10mM，pH＝8)中时荧光很弱，当加入半胱氨酸(Cys)后在37–C反应2小时，反应液在658nm处的荧光明显增强(约100倍)，说明其对半胱氨酸的响应效果好，荧光发射波长为近红外区域，背景干扰小，成像分辨率高，非常有利于生物细胞成像分析。同时该分子探针不受其他离子和氨基酸的干扰，如：FeCl3,MgCl2,CdCl2,CoCl2,BaCl2,CuCl2,AgNO3,ZnCl2,MnCl2,Hg(NO3)2,NaBr,NaF,N2H4,GSH,L-谷氨酸,L-脯氨酸,L-天冬氨酸,L-酪氨酸,DL-组氨酸,2-氨基丙酸等，荧光发射波长处于近红外波段，背景干扰低、样品穿透性强、灵敏度和成像分辨率好。本专利技术的有益效果为：1、本专利技术提供了一种具有背景干扰降低、样品穿透性强、选择性好、灵敏度高和成像分辨率好等优点的荧光“关-开”型近红外检测半胱氨酸的荧光探针，所述荧光探针的荧光强度与检测物半胱氨酸(Cys)浓度呈线性变化，可对半胱氨酸的含量进行定量检测，检测限低至32nM，使得该荧光探针在生物化学领域具有潜在的应用价值。2、本专利技术还提供了所述荧光探针的制备方法，所述制备方法能够制备出所述选择性好、灵敏度高的近红外检测半胱氨酸的荧光探针。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为纯探针(25μM)和探针加入Cys(5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构为：

【技术特征摘要】
1.一种近红外检测半胱氨酸的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构为：。2.权利要求1所述荧光探针的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：步骤一、化合物4-哌嗪-1-苯甲醛的合成a.在反应瓶中加入哌嗪、水、乙二醇单甲醚，将对氟苯甲醛溶于乙二醇单甲醚并置于漏斗中，室温搅拌下缓慢加入反应瓶中，滴加完毕后，回流搅拌反应3-5小时；b.将步骤a中的反应液冷却至室温，再将反应液倒入水中，过滤，然后将滤饼中加入水中，加入盐酸溶液，过滤除去不溶物，滤液用氢氧化钠溶液调节pH至10，使用二氯甲烷(DCM)萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，过滤，减压旋干，石油醚重结晶，过滤，真空干燥得4-哌嗪-1-苯甲醛；步骤二、化合物(E)-2-(5,5-二甲基-3-(4-(哌嗪-1-基)苯乙烯基)环己-2-烯-1-亚基)丙二腈的合成Ⅰ.向反应瓶中加入4-哌嗪-1-苯甲醛、2-(3,5,5-三甲基环己-2-烯亚基)丙二腈、乙醇和催化量的哌啶，搅拌回流反应至完全；Ⅱ.将步骤Ⅰ中的反应液冷却至室温，过滤，滤饼用乙醇洗涤，石油醚洗涤，真空干燥；步骤三、探针(E)-2-(3-(4-(4-((2,4-二硝基苯基)磺酰基)哌嗪-1-基)苯乙烯基)-5,5-二甲基环己-2-烯-1-亚基)丙二腈的合成A....

【专利技术属性】
技术研发人员：肖光汉，
申请(专利权)人：湖南韵邦生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南,43