大鼠肝硬化模型构建方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种大鼠肝硬化模型的构建方法，包括以下步骤：a、获得大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；c、检测并动态分析所述大鼠生理指标，当所述大鼠生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，若所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。根据上述方法构建得到的大鼠肝硬化模型，解决了现有技术中肝硬化建模给药停止后肝硬化指标恢复的难题，降低了建模过程的死亡率，并将所构建的模型与基因表达分析结合，为肝硬化的防治与研究提供了便利。

Construction of rat liver cirrhosis model and its application

The present invention relates to a method of constructing a rat liver cirrhosis model, which includes the following steps: A, rats are obtained, two methylnitrosamine and CCL4 are injected into the rats alternately, B, the physiological index samples of the rats are collected periodically; C, detection and dynamic analysis of the physiological index of the rat, when the physiological indexes of the rats are shown to be reached When the drug was stopped, two methylnitrosamine and CCL4 were stopped; D and the rats were fed for 4~5 weeks to detect the physiological indexes of the rats, and compared with the physiological indexes of the rats when the two methylnitrosamine and CCL4 were stopped. The liver cirrhosis was irreversible, if the liver cirrhosis was not improved. The model of rat liver cirrhosis based on the above methods has solved the problem of the recovery of liver cirrhosis index after the drug cessation in the existing technology, reduced the mortality of the modeling process, and combined the constructed model with the gene expression analysis to provide the convenience for the prevention and study of liver cirrhosis.

【技术实现步骤摘要】
大鼠肝硬化模型构建方法及应用
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，并将其应用于基因表达分析领域。
技术介绍
肝脏是动物体内以代谢功能为主的重要生命器官，调控着多种生理功能，主要包括解毒，储存肝糖原，合成分泌性蛋白质以及生成胆汁等。肝脏本身具有强大的再生能力，正常肝脏经三分之二部分肝切除后，残留的成熟肝细胞可快速增殖，并完全取代和恢复缺失肝脏的体积和功能。但是在罹患各种肝脏疾病，包括肝炎，肝硬化，肝癌，肝脏代谢疾病和肝功能衰竭时，肝脏逐渐失去再生能力，从而导致其生理功能不断下降，最终危害人们的健康和生命。中国是乙型病毒性肝炎的“重灾区”，目前全国乙型肝炎病毒感染人群占人口总数的10％以上，乙肝病毒携带者高达1.2亿，每年还有近百万的新发病例，这些病例中将有20％发展为肝纤维化/肝硬化，肝硬化是临床上常见的慢性进行性肝病。肝硬化是肝脏对各种肝损伤所产生的的弥漫性纤维化和结节再生，是各种慢性肝病的终末期病理阶段。肝硬化在病理上分为代偿期和失代偿期。代偿期在临床上没有特异性症状或是体征，肝功能正常或轻度异常，而失代偿期则有明显的的临床特征及病理变化，肝功能严重受损。目前临床上针对肝硬化没有特别有效的治疗方法，对于失代偿期肝硬化的唯一有效治疗手段就是肝脏移植，但是由于肝脏供体持续紧缺，导致肝硬化患者等不到合适的肝源而死亡的事件屡见不鲜。因此建立类似人类失代偿期肝硬化模型，模拟其发病过程及病理改变，是研究失代偿期肝硬化最迫切的需要。现阶段肝硬化模型建立主要依赖于CCL4来构建。将40％～60％的CCL4橄榄油溶液，根据大鼠体重，按0.13ml/100g给大鼠皮下注射，首剂加倍，每周2次，8～12周形成肝纤维化[1]。DMNA是一种具有肝毒性、细胞毒性和免疫毒性的化学物质，Kitarnura等曾对大鼠进行DMNA诱导实验，按照10mg/kg体重剂量，给予1％DMNA生理盐水稀释液腹腔注射，每周2次，4～8周，肝小叶可出现炎性细胞浸润和出血性坏死病变，且在肝内形成“中心-中心纤维间隔”或“中心-门静脉纤维间隔”[2]。但这些方法构建的肝硬化模型在停止给药后会有一定的好转反应，不利于将其用于肝硬化的临床诊断及治疗，且在建模过程中死亡率较高，而现阶段对肝硬化建模评价指标也没有标准。参考文献：[1]徐安书、文正荣.肝硬化实验动物模型的研究现状[J].医学综述，2010,16(7):1046-1048[2]张贵阳.肝硬化动物模型构建的研究进展[J].综述，2008,13(3):266-269
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，克服利用现有技术中的建模方法构建的肝硬化模型在停止给药后会有一定的好转反应，建模过程死亡率较高的缺陷。本专利技术提供了一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，包括以下步骤：a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本的大鼠生理指标，当所述大鼠的生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。本专利技术公开了一种大鼠不可逆肝硬化模型的构建方法，所述方法包括对大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4，使大鼠肝细胞及肝脏微环境失衡，短期内造成大鼠肝细胞及肝脏微环境的不可逆损伤，采用该方法建模，给药停止后肝硬化指标不会恢复，该方法稳定、可靠、重复性强，降低了肝硬化建模过程中大鼠的死亡率，实现了模拟人类失代偿期肝硬化发病过程及病理指标改变。进一步地，步骤a具体包括：)获取大鼠，并称所述大鼠体重；2)根据所述大鼠体重，按65～75mg/kg的质量浓度计算二甲基亚硝胺用量，溶解二甲基亚硝胺，使其注射浓度为30～40mg/ml，对所述大鼠注射所述二甲基亚硝胺溶液，饲养所述大鼠三天；3)对所述大鼠注射按0.1～0.3ml/kg计算的10％～30％CCL4的橄榄油溶液，饲养所述大鼠三天；4)重复步骤2)至步骤3)共重复7～8次。通过对二甲基亚硝胺和CCL4剂量的严格控制，进一步降低建模过程中大鼠的死亡率，提高成模率。进一步地，步骤b具体地，采集所述大鼠生理指标样本的周期为2周。进一步地，所述大鼠生理指标样本包括大鼠血液样本和大鼠肝组织样本。进一步地，所述大鼠肝组织样本为新鲜肝组织样本和经包埋、切片、保存的大鼠肝组织固定样本。进一步地，所述步骤c中检测所述大鼠生理指标样本具体指，对大鼠肝组织固定样本进行染色。进一步地，所述步骤c中检测所述大鼠生理指标的大鼠血液样本指标包括：谷草转氨酶含量、谷丙转氨酶含量、总血胆红素、血氨浓度、血浆凝血酶原时间和国际标准化比率。进一步地，所述步骤c中显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标，具体包括：a、所述大鼠的谷草转氨酶>175u/l；且b、所述大鼠的谷丙转氨酶＞42u/l；且c、所述大鼠的总血胆红素＞0.45mg/dl；且d、所述大鼠的血氨浓度＞90mmol/l；且e、所述大鼠的血浆凝血酶原时间＞20s；且f、所述大鼠的国际标准化比率＞1.7。进一步地，所述步骤c中显示达到给药停止时间的所述大鼠生理指标，包括：a、所述大鼠活动反应能力下降，眼睛及皮肤泛黄，体重下降10％以上；且b、所述大鼠的腹部膨隆，腹水持续存在；且c、所述大鼠的新鲜肝组织样品肿大、质硬，表面凹凸不平，呈大小颗粒状，肝叶之间有粘连，门静脉突出；且d所述大鼠的肝组织固定样品经染色可判断为肝硬化。进一步地，本专利技术对所述的大鼠的生理指标制定了一套判断不可逆肝硬化建模成功的标准，路线合理，易操作。进一步地，本专利技术还提供了一种采用所述方法构建的大鼠肝硬化模型在基因表达分析或蛋白质表达分析领域的应用。进一步地，所述基因表达分析包括向所述大鼠肝硬化模型中导入携带目的基因HNF4α的重组载体AAV-HNF4α-GFP，使所述目的基因HNF4α在所述大鼠体内表达后检测所述大鼠的生理指标。附图说明图1为实施例一中正常对照组与大鼠不可逆肝硬化模型组在第11周的离体肝脏外观对比图；图2为实施例一中正常对照组与大鼠不可逆肝硬化模型组在第11周时的肝组织病理学对比图；图3为实施例一中现有技术大鼠肝硬化模型与大鼠不可逆肝硬化模型在第11周的离体肝脏外观对比图；图4为实施例一中现有技术大鼠肝硬化模型与大鼠不可逆肝硬化模型在第11周时的肝组织病理学对比图；图5为实施例二中正常对照组、模型实验组和模型对照组在第2周和第4周的肝组织病理变化图；图6为实施例二中正常对照组、模型实验组、模型对照组的肝细胞相对表达HNF4α量对比图；图7为实施例二中正常对照组、模型实验组、模型对照组的肝细胞分泌ALB量的对比图。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本专利技术，但不以任何形式限制本专利技术。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本专利技术的保护范围。下述实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大鼠肝硬化模型构建方法，依次包括如下步骤：a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本的大鼠生理指标，当所述大鼠的生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，若所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。

【技术特征摘要】
1.一种大鼠肝硬化模型构建方法，依次包括如下步骤：a、获取大鼠，给所述大鼠交替注射二甲基亚硝胺和CCL4；b、周期性采集所述大鼠生理指标样本；c、检测并动态分析所述大鼠生理指标样本的大鼠生理指标，当所述大鼠的生理指标显示达到给药停止时间，即停止注射二甲基亚硝胺和CCL4；d、饲养所述大鼠4～5周，检测所述大鼠生理指标，并与停止注射二甲基亚硝胺和CCL4时的所述大鼠生理指标比较，若所述大鼠肝硬化没有好转，则判断肝硬化为不可逆肝硬化。2.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤a具体包括：1)获取大鼠，并称所述大鼠体重；2)根据所述大鼠体重，按65～75mg/kg的质量浓度计算二甲基亚硝胺用量，溶解二甲基亚硝胺，得到注射浓度为30～40mg/ml的二甲基亚硝胺溶液，对所述大鼠注射所述二甲基亚硝胺溶液，饲养所述大鼠三天；3)对所述大鼠注射按0.1～0.3ml/kg计算的10％～30％CCL4的橄榄油溶液，饲养所述大鼠三天；4)重复步骤2)至步骤3)7～8次。3.如权利要求1所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤b中，采集所述大鼠生理指标样本的周期为2周。4.如权利要求1或3所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，步骤b中所述大鼠生理指标样本，包括大鼠血液样本和大鼠肝组织样本。5.如权利要求4所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特征在于，所述大鼠肝组织样本，为大鼠新鲜肝组织样本和经包埋、切片及保存后的大鼠肝组织固定样本。6.如权利要求4所述的大鼠肝硬化模型构建方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：鄢和新，周徐，黄伟健，曾敏，吴红平，唐为忠，翟博，
申请(专利权)人：上海赛立维生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31