基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测制造技术

本发明专利技术公开了基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，特点是具体步骤如下：(1)将硝酸银、L‑半胱氨酸和二次蒸馏水于搅拌器上剧烈搅拌混合均匀，然后振荡器中孵育；(2)利用电化学方法将石墨烯电沉积到裸玻碳电极上，再用0.05％wt Nafion溶液与(1)所得溶液混合滴涂于GO/GCE上，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)；(3)乙酰胆碱酯酶活性检测，乙酰胆碱一步催化生成H2O2，将乙酰胆碱、AChE和胆碱氧化酶混合均匀，孵育生成H2O2，(2)中制得传感器对该溶液检测，特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠；(4)AChE抑制剂马拉硫磷检测，将乙酰胆碱、AChE、马拉硫磷和胆碱氧化酶混合均匀，孵育，(2)中制得传感器对该溶液检测，优点是特异性好、灵敏度高、检测速度快，结果准确可靠。

Electrochemical biosensor based on electrocatalytic activity of peptide mimetics for acetylcholinesterase detection

The invention discloses an electrochemical biosensor based on the electrocatalytic activity of a polypeptide analogue used for the detection of acetylcholinesterase. The specific steps are as follows: (1) agitation and mixing of silver nitrate, L cysteine and two distilled water on a mixer, then incubated in the oscillator; (2) use electrochemical methods. The graphene was electrodeposited on the bare glass carbon electrode, and then mixed with 0.05%wt Nafion solution and (1) solution on GO/GCE to get the electrochemical biosensor based on the electrocatalytic activity of polypeptide analog (CP/GO/GCE). (3) acetylcholinesterase activity detection, acetylcholine catalyzed to produce H2O2, and acetylcholine. AChE and choline oxidase are mixed evenly and incubated to produce H2O2. (2) the sensor is prepared to detect the solution with good specificity, high sensitivity, fast detection speed, accurate and reliable results. (4) the AChE inhibitor malathion is tested, and the acetylcholine, AChE, malathion and choline oxidase are mixed and incubated, and (2) is prepared. The sensor has the advantages of good specificity, high sensitivity, fast detection speed and accurate and reliable detection of the solution.

【技术实现步骤摘要】
基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测
本专利技术涉及电化学生物传感器，尤其是涉及基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器的制备方法及其在乙酰胆碱酯酶检测方面的应用，属于功能材料和生物传感

技术介绍
乙酰胆碱酯酶(AChE)是一种具有羧肽酶和氨肽酶活性的胆碱酯酶，能够选择性的催化水解底物乙酰胆碱。它与细胞的发育和成熟有密切的关系，对神经元的发育和神经的再生有促进作用。在人体内，AChE主要分布于神经系统组织中，能够快速的催化水解神经递质乙酰胆碱而导致神经冲动传递的终止，从而使人体的正常生理功能得到保证。研究表明，AChE与细胞的发育和成熟有紧密的关系，主要表现在：胚胎组织中富含AChE；在原发性肿瘤组织及某些癌症病人的血清中发现AChE的活性增加；AChE的诞生与神经系统的发生过程有直接关系。医学上，AChE功能受到影响会引起精神类疾病，如：阿尔茨海默病和帕金森病等。AChE活性受有机磷农药的特异性抑制，故而可以成为监控有机磷农药的重要的靶标物质。由此可见，AChE与人类健康有十分重要的关系，因此发展AChE活性的分析检测方法有十分重要和现实的意义。有机磷农药是人类最早合成而且至今仍在广泛使用的一类杀虫剂，是目前我国使用最重要的农药之一。有机磷农药与AChE结合会形成磷酰化胆碱酯酶(ChE)，磷酰化ChE很稳定，使酶失去催化水解的能力并逐渐老化，造成乙酰胆碱(ACh)在体内的积累，最终导致胆碱能神经先兴奋后抑制。高含量的有机磷农药可导致惊厥、呼吸困难、心律不齐、缺氧症等急性中毒症状，低含量的有机磷农药亦可经长期慢性毒害导致心脏、肝脏、肾和其他器官的损害。基于酶抑制型的乙酰胆碱酯酶生物传感用于对有机磷农药检测，具有灵敏度高、分析速度快、成本低、能在复杂体系中进行在线连续监测等优点。开发一些易于操作、价格低廉的新型乙酰胆碱酯酶生物传感技术，用于实现对有机磷农药的高灵敏检测仍然具有十分重要的意义。目前国内外文献中已报道的基于乙酰胆碱酯酶生物传感器的检测方法主要有比色法、化学发光法、荧光法、电化学法、石英晶体微天平法等。其中，电化学生物传感器结合了电化学的强大分析功能、特异性识别生物性能，将生物反应的化学信号转换为与被分析物质浓度有关的电信号，从而达到检测目的，具备快速、稳定、选择性强、重现性好、易于操作、步骤简单等优点而被广泛运用，具有良好的应用前景。目前，各种各样新颖的纳米材料涌现，吸引了大量科学工作者的关注并利用这些新材料构建一系列新型电化学生物传感器，具有广泛的应用前景。近年来，由于独特的结构拓扑学和相关的光物理性质使得超分子化学迅速发展，主要通过分子间非共价键相互作用，包括氢键作用、静电作用、π-π堆积、疏水作用以及币族金属-金属相互作用，合理地设计并合成系列功能化的高维超分子结构体系。其中，基于d10币族金属离子“metallophilicity”相互作用、巯基-金属间相互作用以及金属-金属间相互作用构建的超分子结构体系引起广泛关注。目前，以巯基类分子为配体所形成的银离子配位聚合物尤为引入注目，该类配位聚合物以线性的方式配位，每一股链系由近似平面Z-型的-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-S(R)-Ag(I)-片段组成。当我们采用的配体是含巯基氨基酸结构的时候，通过Ag(I)-Ag(I)和巯基-Ag(I)的相互作用形成的配位聚合物具有类似多肽的结构。因此我们采用L-半胱氨酸为配体，与Ag(I)形成了类多肽结构的配位聚合物，由于其具有良好的导电性、催化性能及生物兼容性，能有效电催化H2O2还原，进而检测出电信号，非常适合用于开发电化学生物传感器。本专利技术基于具有比表面积大、边缘位点多、生物相容性好等优点的石墨烯(GO)和具有电催化活性的多肽模拟物(以L-半胱氨酸为配体合成L-半胱氨酸-银配位聚合物，标记为Cys-Ag(I)CP)，构建了一种无标记、简单、成本低廉的乙酰胆碱酯酶电化学生物传感器，其基本原理如下：通过乙酰胆碱在乙酰胆碱酯酶(AChE)和胆碱氧化酶(ChOx)的作用下分解产生的H2O2这种活性分子，再利用多肽模拟物Cys-Ag(I)CP对H2O2体系的催化进行电化学信号检测。该传感器可以用来检测乙酰胆碱酯酶活性并筛选其小分子有机磷抑制剂，特异性好、灵敏度高、结果准确可靠、成本低、快速，且制备过程极其简单。目前，国内外还没有公开任何基于具有电催化活性的多肽模拟物修饰电极的AChE及有机磷小分子抑制剂的电化学生物传感器的相关报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种特异性好、灵敏度高、检测速度快、结果准确可靠、成本低的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，具体步骤如下：(1)具有电催化活性的多肽模拟物的合成依次移取50.0～80.0μL二次蒸馏水、5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为25～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育8～30min，得到半胱氨酸-银配位聚合物(简写为Cys-Ag(I)CP)，具有类似多肽的结构。最后将此多肽类似物移至4℃冰箱避光保存备用。(2)电化学生物传感器的制备a.首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；b.将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰玻碳电极(简写为GO/GCE)；然后用移液器取1.0～4.0μL(1)中溶液与2μL0.05％wtNafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，15～60min后，用二次蒸馏水缓慢冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(简写为CP/GO/GCE)。(3)AChE活性检测依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育15～30min，合成一系列反应液，控制AChE终浓度范围为：0～1.2U/L。利用(2)中所得传感器对该溶液进行检测。(4)AChE抑制剂马拉硫磷的检测依次取0.1～5.0μL浓度为1.0～3.0M的乙酰胆碱水溶液，0.1～5.0μL浓度为102～3×103U/L的AChE，0.5～10.0μL浓度为10～200nM的马拉硫磷，0.1～5.0μL浓度为1.0×102～4.0×103U/L的ChOx及100.0～500.0μL的PBS(0.1M，pH7.0)至总体积为500μL。搅拌器上剧烈搅拌1～3min至混合均匀，然后移至温度为30～37℃、转速调至150～2本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于该电化学生物传感器通过以下方法构建的：首先，利用半胱氨酸和硝酸银合成类多肽结构的配位聚合物Cys‑Ag(I)CP；然后将玻碳电极抛光洗净，电化学方法修饰石墨烯，再将配位聚合物滴涂于电极表面，得电化学生物传感器；最后，配制含不同浓度的乙酰胆碱酯酶和马拉硫磷反应液，检测电化学传感器对反应液的电化学响应。

【技术特征摘要】
1.基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于该电化学生物传感器通过以下方法构建的：首先，利用半胱氨酸和硝酸银合成类多肽结构的配位聚合物Cys-Ag(I)CP；然后将玻碳电极抛光洗净，电化学方法修饰石墨烯，再将配位聚合物滴涂于电极表面，得电化学生物传感器；最后，配制含不同浓度的乙酰胆碱酯酶和马拉硫磷反应液，检测电化学传感器对反应液的电化学响应。2.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，石墨烯修饰玻碳电极的具体方法是：首先将裸玻碳电极(GCE，直径为3mm)抛光清洗处理干净，氮气吹干；然后将石墨烯借助循环伏安法设置电位-1.5～0.5V，扫速为10mV/s电沉积到裸玻碳电极上得到稳定的石墨烯修饰电极，即GO/GCE。3.如权利要求1所述的电化学生物传感器，其特征是，类多肽的半胱氨酸-银配位聚合物(Cys-Ag(I)CP)的合成具体方法为：依次移取50.0～80.0μL二次蒸馏水、5.0～30.0μL浓度为1.0～5.0mM的硝酸银(AgNO3)溶液及5.0～25.0μL浓度为1.0～4.0mM的L-半胱氨酸(L-Cys)溶液，搅拌器上剧烈搅拌2～5min至混合均匀，然后移至温度为25～37℃、转速调至150～200r/min的振荡器中孵育8～30min。最后移至4℃冰箱避光保存备用。4.如权利要求1～3所述的电化学生物传感器，其特征是，传感器的制备方法为：用移液器取1.0～4.0μL(1)中溶液与2μL0.05％wtNafion溶液混合滴涂于GO/GCE上，15～60min后，用二次蒸馏水缓缓冲洗电极，得到基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器(CP/GO/GCE)。5.根据权利要求1～4所述的基于具有电催化活性的多肽模拟物的电化学生物传感器用于乙酰胆碱酯酶检测，其特征在于：利用计时电流法，设置电位为-0.3V，检测CP/GO/GCE在浓度为0.1M、pH7.0的PBS缓冲液中对不同浓度H2O2的电化学响应，根据电流响应大小确定H2O2浓度。6.如权利要求1～4所述的电化学生物传感器，其特征是，AChE活性检测的具体方法为：依次取0.1～5.0μ...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡宇芳，张青青，徐利华，王娇，饶家佳，郭智勇，王邃，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33