用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法技术

用于生物纳米探针的SEM/ESEM—阴极荧光成像方法属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，其特征在于，采用SEM/ESEM和CL组成的联机系统，包括量子点和纳米颗粒在内的纳米探针，选择包括玻璃、导电玻璃、SiO2‑Au‑Si复合膜、Si、SiO2、碳基薄膜在内的任何一种衬底，以SEM外接模式、配以阴极荧光谱的CL全光模式，得到CL像和相对应的SE或TE电子像，以及CL像和电子像的合成像，以SEM快速扫描模式、配以阴极荧光谱的CL单光模式，得到单细胞的CL谱，或单一波长的CL单光像和各电子像，从而得到了由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞和单分子的高分辨光子像和对应的电子像，可以在室温～‑180℃下低温成像，还可以与具有不同发光特性的荧光分子/荧光蛋白探针匹配，并减少高能电子束对生物样品的辐照损伤。

【技术实现步骤摘要】
用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法
本专利技术属于阴极荧光成像
，尤其涉及生物荧光成像
，采用扫描电子显微镜SEM和阴极荧光谱仪CL联机系统，接收电子束激发产生的荧光信号，以及二次电子、背散射电子和透射电子信号，获得由纳米颗粒或半导体量子点探针特异性标记的高分辨和高灵敏度的阴极荧光CL像和对应的电子像，以及单细胞发出的紫外-可见光-红外波段的CL谱，采用电子像和光子像的合成像，以及改变细胞样品衬底的方法，获得衬度增强的CL像，以十几纳米的分辨率显示单个蛋白等单分子在单细胞表面和内部的位置和分布。此方法适用于各类由高分辨场发射扫描电镜/环境扫描电镜和高灵敏阴极荧光谱仪构成的观测系统，纳米颗粒、量子点、荧光染料分子和荧光蛋白等荧光探针标记的生物组织结构，以及半导体、纳米材料、矿物、无机、有机物等各类纳米-微米尺度的发光材料。
技术介绍
扫描电子显微镜SEM，简称SEM，以下同，是以高能电子束为激发源，对各种固体材料，包括生物样品进行高分辨成像的设备。SEM与阴极荧光谱仪CL，简称CL，以下同，构成的观测系统SEM-CL，可获得发光材料的光子像和对应的电子像。因此，CL谱仪技术在多种学科和工程
已到广泛应用，并具有潜在的应用前景。目前，CL技术多用于地质矿物、半导体和IT产业、纳米科技、光电子器件、生物药物等学科和
随着电子显微镜技术的快速发展，由高分辨扫描电镜和高精度阴极荧光谱仪构成的SEM-CL系统，有望在细胞生物学领域得到应用，例如获得以生物纳米探针特异性标定的细胞组织的高分辨荧光像和对应的电子像。在SEM中，高能入射电子与固体样品相互作用，会从样品中激发产生多种信号，主要包括二次电子SE、背散射电子BSE、吸收电子AE、透射电子TE、阴极荧光CL、特征-X射线、电子束感生电流EBIC等(图2)。其中二次电子SE的作用深度最浅，约10nm，形成高分辨像。上述信号形成的电子像，如SE像、BSE像、TE像，以及光子CL像和X-射线元素分布像在材料科学和生命科学领域已得广泛和深入的研究和应用。生物荧光成像技术是细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学、肿瘤学、病理学等生物医药学科普遍采用的可视化研究手段，在疾病诊断、临床检验和治疗、药物研发等方面发挥着重要作用。目前用于生物荧光成像的主要仪器是以光作为激发源的光学显微镜，包括荧光显微镜(FM)，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，以及最新发展的超高分辨光学显微镜(如，STORM等)。根据Abbe成像原理，普通光学显微镜受到光衍射极限的限制，只能达到亚微米级(～200nm)的分辨率。超高分辨光学显微镜利用受激辐射耗尽和单分子定位重构等技术，突破了光学衍射极限，达到数十纳米的分辨率(～20nm)。因此，2014年的诺贝尔化学奖颁发给了此项专利技术的EricBetzig，StefanW.Hell，和WilliamE.Moemer三位科学家。在此之前的2008年，诺贝尔化学奖颁给了Osamu，Shimomura，MartinChalfie，和RogerY.Tsien(钱永健)等科学家，表彰他们发现和发展了用于活细胞荧光成像的绿色荧光蛋白(GFP，EGFP)。这些先进的生物荧光可视化技术极大推动了生物医药学的发展，为医药学研究做出了突出贡献。目前，以光子(包括可见光、紫外光、激光、X-射线等)为激发源的光学显微镜(OM)和生物荧光显微镜(FM)难以显示单分子(蛋白、核酸等)、细胞亚结构(细胞核，细胞器等)的显微特征和分布，不能识别由量子点和纳米颗粒特异性转导的单分子、膜蛋白、基因等十几纳米尺度的细胞结构和纳米药物，也难以获得单细胞的荧光谱信息。近些年来，电子显微镜和光学显微镜的关联技术(Correlativelight-electronmicroscopy，CLEM)得到了快速发展，它结合了电子显微镜的高分辨像和荧光显微镜FM的特异性荧光像。CLEM关联系统中的场发射扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM的分辨率已达到0.6nm，场发射透射电镜TEM的分辨率已达到0.1nm，球差校正透射电镜Cs-TEM的分辨率已达到0.08nm。与此相比，CLEM中的FM-荧光像的分辨率则低得多，通常仅为～200nm，难以与电子显微镜相匹配，因此，多用于为电子显微镜寻找和确定感兴趣观察区。阴极荧光谱仪CL是配置在TEM、SEM及电子探针中，以高能电子束为激发源的观测设备。因此，CL-荧光像的分辨率明显高于FM-荧光像。场发射SEM/ESEM中配置的高灵敏和高精度的阴极荧光谱仪，其CL像可达到十几纳米的分辨率，CL谱的测试精度可达到0.05nm。因此，SEM/ESEM-CL系统在研究纳米颗粒和量子点特异性标识的生物超微结构方面具有明显优势。TEM-CL系统中的CL像分辨率可达到1nm，但它刚进入国内外市场，价格昂贵，尚未被普遍接受。CL成像技术也存在一些问题，如在高真空环境和高能电子辐照下，会使生物样品脱水、变形、细胞组织损坏和凋亡、荧光蛋白和染料分子产生荧光淬灭、存在背底反射光等问题。此外，高能电子激发产生的荧光量子效率较低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于，采用高分辨场发射扫描电镜SEM和环境扫描电镜ESEM配置的高灵敏阴极荧光谱仪CL(SEM/ESEM-CL)，原位收集从样品，特别是从细胞等生物样品中发射出的阴极荧光CL信号和电子信号，电子信号包括从样品表面反射出来的二次电子SE和背散射电子BSE，以及穿透薄样品的透射电子TE(图2)，获得由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞、单分子、单一膜蛋白的高分辨光子像和对应的电子像、由有机荧光基团/染料分子探针等转染的细胞组织的高分辨荧光像和对应的电子像、获得光子和电子的合成像，以及从单细胞中发出的紫外-可见光-红外波段的CL荧光谱。通过采用不同类型的生物探针，选择不同的孵育固定细胞的衬底材料，包括玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO2-Au-Si复合膜、单晶Si、SiO2、碳和石墨烯等碳基薄膜，以及优选SEM/ESEM的工作参数等方法，提高荧光量子效率，获得荧光增强的CL像和CL谱，降低有机分子的荧光淬灭现象，并减少电子束对生物样品的辐照损伤。此方法适用于各种场发射扫描电镜SEM和环境扫描电镜ESEM，及高敏感阴极荧光谱仪CL，由纳米颗粒、量子点、荧光分子和荧光蛋白等构成的生物探针和混合探针，以及生物样品、药物、半导体、有机、无机、氧化物、矿物、碳和石墨烯等发光材料和发光器件。本专利技术的特征在于，是在一个用于生物纳米探针的阴极荧光成像系统，以下简称系统中，依次按以下步骤实现的：步骤(1)，构建系统，是一个扫描电子显微镜SEM/环境扫描电镜ESEM和一个阴极荧光谱仪CL组成的联机系统，符号“/”表示“或者”；系统中的扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM主要包括：电子枪1、三级电磁透镜2、SEM电子束控制单元、SEM样品室、电子探测器控制单元、样品台控制单元，及SEM主机。系统中的阴极荧光谱仪CL主要包括：CL接收镜11、分光光谱仪、图像扫描控制器，及CL主机；所述SEM样品室包括：设在SEM样品室底座12上的环形透射电子TE探测器TED6、位于所述环形透射电子TE探测器TED6上端面上方的TE样品台5、本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法，其特征在于，是在一个用于生物纳米探针的阴极荧光成像系统，以下简称系统中，依次按以下步骤实现的：步骤(1)，构建系统，是一个扫描电子显微镜SEM/环境扫描电镜ESEM和一个阴极荧光谱仪CL组成的联机系统，符号“/”表示“或者”；系统中的扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM主要包括：电子枪(1)、三级电磁透镜(2)、SEM电子束控制单元、SEM样品室、电子探测器控制单元、样品台控制单元，及SEM主机。系统中的阴极荧光谱仪CL主要包括：CL接收镜(11)、分光光谱仪、图像扫描控制器，及CL主机；所述SEM样品室包括：设在SEM样品室底座(12)上的环形透射电子TE探测器TED(6)、位于所述环形透射电子TE探测器TED(6)上端面上方的TE样品台(5)、底部固定在底座上面、横臂位于所述TE样品台(5)上方的呈“T”字形的SEM样品台(7)、依次叠压在所述SEM样品台(7)横臂上端面的SEM样品托(8)、样品衬底(9)和样品(10)，一个一端悬臂式伸入到所述SEM样品室右侧面上的阴极荧光CL接收镜(11)，一个位于SEM样品台(7)左侧面上的高真空二次电子SE探测器ETD(4)，以及一个低真空二次电子SE探测器LFS(3)；所述样品台控制单元用于通过控制所述SEM样品台(7)和TE样品台(5)的升降和水平移动来调整入射电子束与样品观测点之间的相对位置；所述SEM电子束控制单元用于控制入射电子束在SEM样品(10)表面或TE样品台(5)上的样品上逐点扫描；所述电子探测器控制单元的三个输入端分别与所述高真空二次电子SE探测器ETD(4)、低真空二次电子SE探测器LFS(3)，以及透射电子TE探测器TED(6)的输出端相连；所述SEM主机的一个输入端与所述电子探测器控制单元的输出端相连，而所述SEM主机的另外二个输出端分别与所述SEM电子束控制单元的输入端和SEM显示器的输入端相连；所述分光光谱仪与阴极荧光CL接收镜(11)的输出端相连，接收CL光子信号并在单光模式下进行分光，或在全光模式下让光子通过分光光谱仪而不分光，然后将CL信号输入到CL探测器控制单元；所述CL探测器控制单元，包括一个高灵敏光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和高灵敏InGaAs红外探测器，分别依次接收和放大分光光谱仪输出的紫外‑可见光‑红外波段的CL光子，并把光子信号输入到CL谱仪的图像扫描控制器；所述图像扫描控制器在输入CL信号的同时从所述电子探测器控制单元接收包括二次电子SE和透射电子TE在内的电子信号，然后在CL显示器上同时显示全光或单光CL像和对应的电子像，或显示CL谱，并将CL像和对应的电子像合成，形成光子和电子的合成像；步骤(2)，按以下步骤制备样品，所述样品是指：把生物纳米探针或荧光分子探针通过链霉素亲和生物素作用，利用中间分子与细胞上的特定分子偶联，得到特异性标记的单细胞、细胞亚结构及单分子生物样品，以实现在单细胞和单分子水平上的荧光成像，所述纳米探针，至少包括纳米颗粒、量子点、核‑壳结构的量子点中的任意一种，所述荧光分子探针至少包括荧光蛋白和荧光染料分子中的任意一种，所述介导探针与特定分子结合的中间分子至少包括核酸适配体分子、抗体分子、多肽分子、小分子化合物中的任何一种，所述标记的特定单分子至少包括细胞蛋白分子、核糖核酸RNA中的任何一种分子；步骤(2.1)，把所述细胞样品(10)孵育固定在一个样品衬底(9)上，所述衬底(9)是玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO2‑Au‑Si复合膜，单晶Si、SiO2、碳或石墨烯等碳质薄膜中的任何一种；步骤(2.2)，用上述方法制备的生物纳米探针对固定好的细胞样品进行特异性标定，或用荧光蛋白和荧光染料分子探针中的一种探针对细胞进行转染表达，除去未结合的非特异性探针，得到特异性探针标记后形成的生物探针和探针复合体，包括如下几种：·蛋白质—核酸适配体—生物素—链霉亲和素—纳米探针·蛋白质—核酸适配体—荧光分子探针·蛋白质—抗体—纳米单针/荧光分子探针·蛋白质—抗体—生物素—链霉亲和素—纳米探针和荧光分子探针·特定蛋白质—荧光蛋白，形成融合蛋白·核荧光染料分子步骤(3)，把经过步骤(2)处理的样品(10)放在SEM样品托(8)上固定粘贴，把所述SEM样品托(8)安装在所述SEM样品室的所述SEM样品台(7)上，并使入射电子扫描成像区正对着垂直入射电子束的方向，步骤(4)，把所述分光光谱仪先分别与所述CL探测器控制单元的光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和InGaAs红外探测器连接后，再分别连接到与所述图像扫描控制器，所述图像扫描控制器与CL主机连接，收集所述SEM样品(10)或TE样品发射出的光子和电子信号，在CL显示器上同时显示CL像和相对应的二次电子SE...

【技术特征摘要】
1.用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法，其特征在于，是在一个用于生物纳米探针的阴极荧光成像系统，以下简称系统中，依次按以下步骤实现的：步骤(1)，构建系统，是一个扫描电子显微镜SEM/环境扫描电镜ESEM和一个阴极荧光谱仪CL组成的联机系统，符号“/”表示“或者”；系统中的扫描电镜SEM/环境扫描电镜ESEM主要包括：电子枪(1)、三级电磁透镜(2)、SEM电子束控制单元、SEM样品室、电子探测器控制单元、样品台控制单元，及SEM主机。系统中的阴极荧光谱仪CL主要包括：CL接收镜(11)、分光光谱仪、图像扫描控制器，及CL主机；所述SEM样品室包括：设在SEM样品室底座(12)上的环形透射电子TE探测器TED(6)、位于所述环形透射电子TE探测器TED(6)上端面上方的TE样品台(5)、底部固定在底座上面、横臂位于所述TE样品台(5)上方的呈“T”字形的SEM样品台(7)、依次叠压在所述SEM样品台(7)横臂上端面的SEM样品托(8)、样品衬底(9)和样品(10)，一个一端悬臂式伸入到所述SEM样品室右侧面上的阴极荧光CL接收镜(11)，一个位于SEM样品台(7)左侧面上的高真空二次电子SE探测器ETD(4)，以及一个低真空二次电子SE探测器LFS(3)；所述样品台控制单元用于通过控制所述SEM样品台(7)和TE样品台(5)的升降和水平移动来调整入射电子束与样品观测点之间的相对位置；所述SEM电子束控制单元用于控制入射电子束在SEM样品(10)表面或TE样品台(5)上的样品上逐点扫描；所述电子探测器控制单元的三个输入端分别与所述高真空二次电子SE探测器ETD(4)、低真空二次电子SE探测器LFS(3)，以及透射电子TE探测器TED(6)的输出端相连；所述SEM主机的一个输入端与所述电子探测器控制单元的输出端相连，而所述SEM主机的另外二个输出端分别与所述SEM电子束控制单元的输入端和SEM显示器的输入端相连；所述分光光谱仪与阴极荧光CL接收镜(11)的输出端相连，接收CL光子信号并在单光模式下进行分光，或在全光模式下让光子通过分光光谱仪而不分光，然后将CL信号输入到CL探测器控制单元；所述CL探测器控制单元，包括一个高灵敏光电倍增管PMT探测器、快速CCD探测器和高灵敏InGaAs红外探测器，分别依次接收和放大分光光谱仪输出的紫外-可见光-红外波段的CL光子，并把光子信号输入到CL谱仪的图像扫描控制器；所述图像扫描控制器在输入CL信号的同时从所述电子探测器控制单元接收包括二次电子SE和透射电子TE在内的电子信号，然后在CL显示器上同时显示全光或单光CL像和对应的电子像，或显示CL谱，并将CL像和对应的电子像合成，形成光子和电子的合成像；步骤(2)，按以下步骤制备样品，所述样品是指：把生物纳米探针或荧光分子探针通过链霉素亲和生物素作用，利用中间分子与细胞上的特定分子偶联，得到特异性标记的单细胞、细胞亚结构及单分子生物样品，以实现在单细胞和单分子水平上的荧光成像，所述纳米探针，至少包括纳米颗粒、量子点、核-壳结构的量子点中的任意一种，所述荧光分子探针至少包括荧光蛋白和荧光染料分子中的任意一种，所述介导探针与特定分子结合的中间分子至少包括核酸适配体分子、抗体分子、多肽分子、小分子化合物中的任何一种，所述标记的特定单分子至少包括细胞蛋白分子、核糖核酸RNA中的任何一种分子；步骤(2.1)，把所述细胞样品(10)孵育固定在一个样品衬底(9)上，所述衬底(9)是玻璃、氧化铟锡ITO导电玻璃、SiO2-Au-Si复合膜，单晶Si、SiO2、碳或石墨烯等碳质薄膜中的任何一种；步骤(2.2)，用上述方法制备的生物纳米探针对固定好的细胞样品进行特异性标定，或用荧光蛋白和荧光染料分子探针...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉元，王丽，韩晓东，张隐奇，毛圣成，李劲涛，盛望，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：北京,11