椭圆小球藻NF-YC基因及其应用制造技术

本发明专利技术提供了椭圆小球藻NF‑YC基因及其应用，属于微藻基因工程技术领域。椭圆小球藻NF‑YC基因序列如SEQ ID No.1所示，其编码蛋白序列如SEQ ID No.2所示。该基因来源于椭圆小球藻(Chlorella ellipsoidea)，将其转化拟南芥，发现转CeNF‑YC的拟南芥总脂肪酸含量比野生型Col‑0提高了9.8％‑15.4％，千粒重比野生型增加18.4％‑44.9％。可见椭圆小球藻NF‑YC基因能大幅提高植物细胞的总油脂含量，可将该基因应用于生物油脂制备领域及作物改良，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
椭圆小球藻NF-YC基因及其应用
本专利技术属于微藻基因工程领域，具体地说，涉及椭圆小球藻NF-YC基因、其编码蛋白及应用。
技术介绍
随着传统能源的过度消耗和日益增长的能源需求，能源问题日益严峻，可替代能源的研究成为关注的热点。微藻由于含油量高，易于培养，单位土地油脂产量远高于其他油料作物，被认为是最优潜力的能源资源之一。微藻是一类单细胞低等植物，繁殖能力强，对生长环境要求低，易于培养，光合作用效率高，含油量高。微藻细胞中的三酰甘油(TAG)可达到干重的20％-50％。三酰甘油(TAG)是植物贮藏脂类的主要贮存形式，它广泛分布于植物的种子、花粉、果实和叶片等器官中，主要参与细胞膜脂构建、能量代谢、逆境反应、种子萌发和花粉发育等众多生命活动。因此，微藻中存在着优良的与油脂代谢相关的候选基因资源。NF-Y(NuclearFactorY)超基因家族是一类可以结合CCAAT-box的广泛地存在于真核生物中的转录因子家族，它由3个基因家族构成即NF-YA、NF-YB和NF-YC。在高等植物中，该基因家族的成员对油脂合成和积累、植物的生长发育及抗逆等方面都有重要影响。有研究指出高等植物来源的NF-Y基因在CaMV35S启动子驱动下或其他种子特异启动子如未改造的Napin启动子会使得植株发育异常，或种子萌发异常(Muetal.,2008,PlantPhysiology,148:1042-1054；Tanetal.,2011,PlantPhysiol,156:1577-1588)。这使得该基因的应用受到限制。目前关于椭圆小球藻中NF-YC基因及其功能未有相关研究报道。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供椭圆小球藻(Chlorellaellipsoidea)NF-YC及其编码蛋白的应用。本专利技术首先提供椭圆小球藻NF-YC蛋白，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。本专利技术提供了编码椭圆小球藻NF-YC蛋白的基因，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。本专利技术提供了含有上述编码椭圆小球藻NF-YC蛋白的基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高细胞中总脂肪酸含量中的应用。所述细胞为植物细胞。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在制备总脂肪酸含量高的转基因植物中的应用。所述的植物为油类作物。所述油类作物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、蓖麻、棕榈、芝麻或花生。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在提高植物种子千粒重中的应用。所述的植物为油菜、拟南芥、向日葵、大豆、番茄、棕榈、蓖麻、芝麻、花生、水稻、小麦或玉米。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在植物种质资源改良中的应用。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产食用油中的应用。本专利技术提供了上述椭圆小球藻NF-YC蛋白或编码其的基因或含有该基因的生物材料在生产生物柴油中的应用。本专利技术根据椭圆小球藻的转录组的注释，筛选到CeNF-YC的cDNA序列，提取椭圆小球藻的mRNA，反转录后，克隆CeNF-YC的全长CDS序列，并构建到入门载体上，之后通过重组反应，将其构建到植物表达载体上，筛选阳性克隆，转化农杆菌(GV3101)后侵染植物。结果发现，本专利技术提供的核苷酸序列为SEQIDNO.1的、来源于椭圆小球藻的CeNF-YC在CaMV35S启动子驱动下异源表达于拟南芥中，转基因拟南芥都不会出现抑制拟南芥生长发育等不良的农艺性状，并且显著提高了转基因拟南芥种子中的油脂含量和种子的千粒重：转CeNF-YC的拟南芥总脂肪酸含量比野生型Col-0提高了9.8％-15.4％，千粒重比野生型增加18.4％-44.9％。拟南芥是模式植物，在拟南芥菜中能发挥作用的基因在多种作物中有类似的功效，因此本专利技术的核苷酸序列为SEQIDNO.1的椭圆小球藻CeNF-YC基因可用于油菜，大豆，棉花，花生，棕榈等油料植物的遗传育种以提高油脂含量及千粒重，以及用于小麦，水稻，玉米等作物的育种，以提高种子的千粒重。附图说明图1为CeNF-YC基因入门载体图谱。图2为CeNF-YC基因植物表达载体图谱。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1椭圆小球藻NF-YC基因的获得与表达载体的构建1、椭圆小球藻总RNA的提取收集足量的椭圆小球藻细胞，迅速加入液氮，用研钵充分研磨后，取50-100mg的粉末，加入1mLTrizol(Invitrogen)提取缓冲液，充分混匀后，静止10min；加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入0.2mL氯仿，充分混匀后，13,500rpm离心10min；取上清，加入一半体积的异丙醇，室温静止30-50min，13,500rpm离心10min，弃上清。加入75％的乙醇，悬浮沉淀，10,000rpm离心5min，弃上清；加入100％的乙醇，悬浮沉淀，10000rpm离心5min，弃上清；在超净工作台中吹干(大于3-5min)；加50μLDEPC水溶解。-80℃保存待用2、椭圆小球藻cDNA的合成利用全式金公司的去DNA反转录试剂盒，利用mRNA生产cDNA。其体系为5μgtotalRNA，50mMOligo(dT18)，10μL2×TSReactionmix，1μLTransScriptRT/RIEnzymeMix，1μLgDNARedmover，用RNase-free水补至20μL。轻轻混匀后，42℃孵育40-50min，85℃失活5min。-20℃保存待用。3、CeNF-YC基因的获得及表达载体的构建根据转录组中cDNA序列，预测其完整的CDS，并翻译为氨基酸序列后，通过在NCBI蛋白数据库中比对，进一步确定CeNF-YC基因的完整性。以cDNA作为模板，设计上下游扩增引物(上游引物5-AGCAGGCTTTGACTTTATGGACAGTGCAAACAATAATGGTC-3,下游引物5-TGGGTCTAGAGACTTTCCTTCGCCCTGCTTCTGTTGGTG-3)，用高保真Taq酶扩增CeNF-YC基因。扩增程序为2min98℃预变性，30s98℃，30s60℃，30s72℃，共35个循环。PCR产物纯化后，待用。利用In-fusion体系，将PCR产物连接到入门载体(命名为pGWC-CeNF-YC，图1)上，具体如下：1μL酶切后的pGWCm(100ng/μL，用AhdI酶切)，1μLPCR产物(80ng/μL)，2μLIn-fusionMix，50℃50-60min；转大肠杆菌DH5α，通过PCR鉴定筛选阳性克隆，经测序鉴定后，通过gateway体系，将其构建到植物表达载体上，命名为pCe本文档来自技高网...

【技术保护点】
椭圆小球藻NF‑YC蛋白，其特征在于，其具有：1)如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；或2)SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.椭圆小球藻NF-YC蛋白，其特征在于，其具有：1)如SEQIDNo.2所示的氨基酸序列；或2)SEQIDNo.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述蛋白的基因，其具有：1)SEQIDNo.1所示的核苷酸序列；或2)SEQIDNo.1所示核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或几个核苷酸；或3)在严格条件下与1)限定的DNA序列杂交的核苷酸序列。3.含有权利要求2所述基因的生物材料，所述生物材料为载体、宿主细胞或表达盒。4.权利要求1所述的椭圆小球藻NF-YC蛋白或权利要求2所述的基因或权利要求3所述的生物材料在提高细胞中总脂肪酸含量中的应用。5.如权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赞民，范成明，陈宇红，
申请(专利权)人：中国科学院遗传与发育生物学研究所，
类型：发明
国别省市：北京,11