一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的小球藻突变藻株及其培养方法技术

一种高产玉米黄素及其他人体必需类胡萝卜素的小球藻突变藻株及其培养方法，将小球藻Chlorella zofingiensisATCC 30412进行亚硝基胍诱变处理，处理后的藻细胞涂布于含DPA的Kuhl固体培养基上培养，挑选培养基上的单藻落于Kuhl液体培养基中培养，至对数中后期时加入葡萄糖进行类胡萝卜素合成诱导，通过检测藻体中类胡萝卜素种类变化和含量，得到一株高产玉米黄素、叶黄素和β‑胡萝卜素藻株并命名为CZ‑ZEA1。CZ‑ZEA1在30g/L的葡萄糖诱导条件下生物量达到12.95g/L，玉米黄素、叶黄素和β‑胡萝卜素的含量分别达到2.176mg/g、1.10mg/g和1.211mg/g。该突变藻株属绿藻可食用藻种，含有高量的和最佳比例的人体必需类胡萝卜素，尤其是自然资源十分稀缺的玉米黄素，是理想的预防中老年人眼睛退化和病变的新资源功能食品，具有很好的开发应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物工程领域，具体涉及利用亚硝基胍诱变产生的一株高产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株及其培养方法。技术背景玉米黄素是一种黄色的羟基化类胡萝卜素，其学名为3,3’-二羟基-β-胡萝卜素，和β-胡萝卜素一样，玉米黄素具有很强的着色和抗氧化功能。玉米黄素与其同分异构体叶黄素是眼睛视网膜黄斑的主要色素成分，它们在黄斑中的含量比为2：1。近年来的研究表明玉米黄素有助于预防白内障、老年性黄斑退变、癌症以及低密度脂蛋白的氧化，此外玉米黄素还被作为饲料添加剂而广泛运用于家禽和鱼类养殖中。目前市场上玉米黄素的主要来源是生物提取，天然来源的玉米黄素主要从红椒、黄玉米等植物中提取。但是这些植物中玉米黄素的含量最高仅为400μg/g，而且植物生长周期长、利用植物生产玉米黄素还会占用较多的土地和水资源。微生物资源尤其是植物祖先单细胞绿藻，生长周期短，生物量高，是理想的类胡萝卜素资源。如杜氏盐藻用于商业化生产天然β-胡萝卜素，雨生红球藻用于生产虾青素。植物和绿藻通常含有较高量的叶黄素但不积累高量的玉米黄素。杜氏盐藻突变体zea1因催化玉米黄素成下游类胡萝卜素的基因失去功能而能积累玉米黄素高达6mg/g细胞干重，是具有商业化应用价值的绿藻。然而光合自养的杜氏盐藻生物量低(约1g/L)，限制了该藻的应用潜能。研发高产玉米黄素以及其他人体必需类胡萝卜素的绿藻新资源具有重大的商业应用意义。迄今为止，现有技术中未见有一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的，为小球藻(Chlorellazofingiensis,ATCC30412)的诱变藻株ZEA1的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的藻株，其为小球藻(Chlorellazofingiensis,ATCC30412)的诱变藻株ZEA1，以及所述玉米黄素和β-胡萝卜素高产藻株ZEA1的培养方法。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案：一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株，其为小球藻Chlorellazofingiensis,ATCC30412的诱变藻株ZEA1,保藏机构和保藏号为CGMCCNo.12948。如所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，该突变小球藻株在30g/L的葡萄糖诱导条件下，生长速率高于野生型，其生物量为野生型的1.2倍，达12.95g/L，玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素的含量分别为2.176mg/g，1.10mg/g和1.211mg/g。如所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，该突变小球藻株属绿藻可食用藻种，含有高量的和最佳比例的玉米黄素：叶黄素2∶1的人体必需类胡萝卜素，以及自然资源稀缺的玉米黄素。如所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，该突变小球藻株中催化β-胡萝卜素成角黄质和玉米黄素成虾青素的酮化酶基因BKT1基因74位的碱基由胸腺嘧啶T置换成了鸟嘌呤G，致使其发生无义突变。如所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，该突变小球藻株经HPLC测定，在Kuhl+30g/L葡萄糖的培养条件下积累高达2.176mg/g和1.17mg/g的玉米黄素和叶黄素，它们的比例1.86∶1非常接近眼睛黄斑中这两种色素的比例2∶1。如所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，该突变小球藻株含有1.211mg/g人体必需的β-胡萝卜素，且各种类胡萝卜素的含量和比例在不同代数的藻体中均表现出高度稳定，其玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素的产量分别达到36.79mg/L、28.65mg/L和26.18mg/L。本专利技术还提供了所述的任一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其是由下述方法所得到的：先将小球藻ChlorellazofingiensisATCC30412进行亚硝基胍诱变处理，处理后的藻细胞涂布于含DPA的Kuhl固体培养基上培养，挑选培养基上的单藻落于Kuhl液体培养基中，培养至对数中后期时加入葡萄糖进行类胡萝卜素合成诱导，检测藻体中类胡萝卜素种类变化和含量，所述的Kuhl培养基的成分为(L)：1.01gKNO3；0.62gNaH2PO4·H2O；0.089gNa2HPO4·2H2O；0.247gMgSO4·7H2O；14.7mgCaCl2·2H2O；6.95mgFeSO4·7H2O；0.061mgH3BO3；0.169mgMnSO4·H2O；0.287mgZnSO4·7H2O；0.0025mgCuSO4·5H2O；and0.01235mg(NH4)6MO7O24·4H2O；pH为6.8。如所述的任一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其是由下述方法所得到的：1)取对数生长期的小球藻ChlorellazofingiensisATCC30412藻液稀释至105个细胞/ml，取藻液5ml，2000rpm离心10min，弃上清，用20mL50mMPBS，pH7.0缓冲液重悬，2000rpm离心10min；2)弃上清，加10mL50mMPBS，pH为7.0和100μl20mg/mLMNNG重悬细胞，混匀后于25℃恒温摇床遮光处理1h；3)将步骤2)中处理后的细胞2000rpm离心10min，弃上清，藻细胞沉淀用PBS清洗2次，藻细胞加新鲜Kuhl液体培养基，于恒温摇床遮光孵育24h；所述的Kuhl培养基的成分为(L)：1.01gKNO3；0.62gNaH2PO4·H2O；0.089gNa2HPO4·2H2O；0.247gMgSO4·7H2O；14.7mgCaCl2·2H2O；6.95mgFeSO4·7H2O；0.061mgH3BO3；0.169mgMnSO4·H2O；0.287mgZnSO4·7H2O；0.0025mgCuSO4·5H2O；and0.01235mg(NH4)6MO7O24·4H2O；pH为6.8；4)将步骤3)的藻细胞2000rpm离心10min，藻细胞用新鲜培养基稀释并涂布于诱变筛选的含30μM二苯胺的Kuhl平板，于25℃恒温光照培养箱培养；5)从步骤4)诱变筛选平板上挑取小球藻单克隆并编号，接种于装有3mL含30μM二苯胺的Kuhl液体培养基的12mL培养管中，置于恒温摇床培养10天，之后将藻液以10％的接种量接种于含10mL含30μM二苯胺的Kuhl培养基的100mL锥形瓶中，于恒温光照摇床培养4天；6)取步骤5)的藻细胞以10％的接种量接种于含50mLKuhl培养基的250mL锥形瓶中，于恒温光照摇床培养4天至对数中期，随后添加不同浓度0g/L、10g/L、15g/L、30g/L、50g/L、60g/L的葡萄糖进行诱导，通过HPLC检测其色素成分和含量的变化，HPLC检测出在诱导条件下能积累高含量的玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素的保藏号为CGMCCNo.12948的藻株。如所述的任一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，所述的突变小球藻株CGMCCNo.12948是以小球藻为出发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种产玉米黄素和β‑胡萝卜素的突变小球藻株，其为小球藻Chlorella zofingiensis,ATCC 30412的诱变藻株ZEA1，保藏机构和保藏号为CGMCC No.12948。

【技术特征摘要】
1.一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株，其为小球藻Chlorellazofingiensis,ATCC30412的诱变藻株ZEA1，保藏机构和保藏号为CGMCCNo.12948。2.如权利要求1所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于该突变小球藻株在30g/L的葡萄糖诱导条件下，生长速率高于野生型，其生物量为野生型的1.2倍，达12.95g/L，玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素的含量分别为2.176mg/g，1.10mg/g和1.211mg/g。3.如权利要求1所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于该突变小球藻株属绿藻可食用藻种，含有高量的和最佳比例的玉米黄素：叶黄素2∶1的人体必需类胡萝卜素，以及自然资源稀缺的玉米黄素。4.如权利要求1所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于该突变小球藻株中催化β-胡萝卜素成角黄质和玉米黄素成虾青素的酮化酶基因BKT1基因74位的碱基由胸腺嘧啶T置换成了鸟嘌呤G，致使其发生无义突变。5.如权利要求1所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于该突变小球藻株经HPLC测定，在Kuhl+30g/L葡萄糖的培养条件下积累高达2.176mg/g和1.17mg/g的玉米黄素和叶黄素，它们的比例1.86∶1非常接近眼睛黄斑中这两种色素的比例2∶1。6.如权利要求1所述的一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于该突变小球藻株含有1.211mg/g人体必需的β-胡萝卜素，且各种类胡萝卜素的含量和比例在不同代数的藻体中均表现出高度稳定，其玉米黄素、叶黄素和β-胡萝卜素的产量分别达到36.79mg/L、28.65mg/L和26.18mg/。7.如权利要求1-6所述的任一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于其是由下述方法所得到的：先将小球藻ChlorellazofingiensisATCC30412进行亚硝基胍诱变处理，处理后的藻细胞涂布于含DPA的Kuhl固体培养基上培养，挑选培养基上的单藻落于Kuhl液体培养基中，培养至对数中后期时加入葡萄糖进行类胡萝卜素合成诱导，检测藻体中类胡萝卜素种类变化和含量，所述的Kuhl培养基的成分为(L)：1.01gKNO3；0.62gNaH2PO4·H2O；0.089gNa2HPO4·2H2O；0.247gMgSO4·7H2O；14.7mgCaCl2·2H2O；6.95mgFeSO4·7H2O；0.061mgH3BO3；0.169mgMnSO4·H2O；0.287mgZnSO4·7H2O；0.0025mgCuSO4·5H2O；and0.01235mg(NH4)6MO7O24·4H2O；pH为6.8。8.如权利要求1-6所述的任一种产玉米黄素和β-胡萝卜素的突变小球藻株CGMCCNo.12948，其特征在于其是由下述方法所得到的：1)取对数生长期的小球藻ChlorellazofingiensisATCC30412藻液稀释至105个细胞/ml，取藻液5ml，2000rpm离心10min，弃上清，用20mL50mMPBS，pH7.0缓冲液重悬，2000rpm离心10min；2)弃上清，加10mL50mMPBS，pH为7.0和100μl20mg/mLMNNG重悬细胞，混匀后于25℃恒温摇床遮光处理1h；3)将步骤2)中处理后的细胞2000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄俊潮，黄为平，林燕，
申请(专利权)人：中国科学院昆明植物研究所，
类型：发明
国别省市：云南;53