可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供了一种可控自交联巯基化透明质酸‑胶原复合水凝胶及其制备方法，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与I型胶原或Ⅱ型胶原组成，I型胶原或Ⅱ型胶原胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中。该复合水凝胶兼备刚性和弹性，力学性能良好，能促进软骨细胞的铺展生长和有利于细胞维持表型，可缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的容易收缩以及细胞粘附性差的不足，在软骨损伤修复领域有着重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用
本专利技术属于生物材料领域，涉及一种可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法，以及该可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用。
技术介绍
关节软骨缺损是一类常见的骨科疾病，由于关节软骨无血管，无淋巴，无神经，因而较难自我修复。现有的治疗方法主要依赖于自体软骨细胞移植，但是受限于供体细胞的不足以及在培养过程中易分化。组织工程作为一种前沿的技术吸引了人们的眼球。组织工程最基本的原则就是体外分离扩增的软骨细胞协同生长因子种植在支架材料上，将其移植到人体内后可以形成新的软骨组织以达到软骨修复与重建的目的。因此，一个理想的支架对于缺损软骨的重建是至关重要的。水凝胶有利于维持软骨细胞圆形或者椭圆形的形态，这个形态同软骨细胞在天然的软骨基质中的形态一致，水凝胶具有好的渗透性，有利于营养物质的传输和代谢活动的进行，细胞可以被水凝胶三维包裹在水凝胶中，因此，水凝胶已被广泛应用于软骨组织工程并且展现出了巨大的潜力。透明质酸和胶原是软骨细胞基质最主要的成分。胶原是细胞基质的重要结构蛋白。研究发现，胶原不但具有良好的生物相容性和可降解性，而且包含许多细胞粘附位点和刺激种子细胞合成新胶原的分子信号。然而，单一的胶原支架存在力学强度差、降解速度快和免疫原性等问题，胶原同细胞在体外培养时还会出现严重的收缩，无法满足实际应用的要求。透明质酸也是细胞基质的重要成分，它的结构和生物学性能可调控细胞信号、伤口愈合和基质的形成。透明质酸水凝胶有良好的生物相容性、生物降解性和高保水性和促进软骨形成的特性，但是透明质酸的生物材料会抑制细胞附着，也无法达到应用要求。CN104892962A公开了一种巯基/二硫键可控自交联透明质酸水凝胶，但该水凝胶仍然会抑制细胞附着，其细胞粘附性较差，软骨细胞在其上铺展困难。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶及其制备方法与应用，以有效缓解现有用于软骨修复的凝胶材料存在的容易收缩以及细胞粘附性差的不足。本专利技术提供的可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，所述胶原为I型胶原或Ⅱ型胶原，所述交联巯基化透明质酸是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～70％，上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶中，胶原的含量为4.5～10.5mg/mL，交联巯基化透明质酸的含量为4.5～10.5mg/mL。上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶中，巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1MDa～3.0MDa。巯基化透明质酸的制备方法可参见CN104892962A。本专利技术还提供了一种上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，步骤如下：(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸溶解于α-MEM培养基中形成浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液以及抗坏血酸得到，(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(2)中，优选在冰浴条件下进行，上述方法的步骤(3)优选将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液冰浴条件下混匀。上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(3)中，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置不超过1min即可使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法的步骤(1)中，α-MEM培养基中青霉素-链霉素混合液的体积浓度优选为0.8％～1.2％，抗坏血酸的浓度优选为45～55μg/mL。本专利技术还提供了上述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用，优选将所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架。采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架的步骤如下：(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸，溶解于培养基中形成巯基化透明质酸浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶，即得软骨组织工程三维支架；或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液混匀，调节pH值至7.4～7.8后立即注射至生物体体内的待修复部位，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，即得软骨组织工程三维细胞支架；或者，将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液灭菌并按照的体积比混匀，然后加入软骨细胞悬浮液并混匀，调节pH值至7.4～7.8，加入模具中，在34～40℃静置，巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成包裹软骨细胞的复合水凝胶，将包裹软骨细胞的复合水凝胶从模具中取出浸没于培养基中，置于培养箱中在34～40℃、3％～5％的CO2的条件下培养至少1天即得软骨组织工程三维细胞支架，培养期间定期更换培养基；所述培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液、抗坏血酸以及胎牛血清得到。采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，步骤(3)中按照5×105～5×106cells/mL的比例向巯基化透明质酸溶液与胶原溶液的混合液中加入软骨细胞悬液，所述软骨细胞可从出生1～5天的幼兔的关节中提取。采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工程三维细胞支架或软骨组织工程三维支架时，所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。采用可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨本文档来自技高网...

【技术保护点】
可控自交联巯基化透明质酸‑胶原复合水凝胶，其特征在于，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，所述胶原为I型胶原或Ⅱ型胶原，所述交联巯基化透明质酸是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～70％，

【技术特征摘要】
1.可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于，该复合水凝胶由交联巯基化透明质酸水凝胶与胶原组成，胶原分布在交联巯基化透明质酸的三维交联网络结构中，所述胶原为I型胶原或Ⅱ型胶原，所述交联巯基化透明质酸是由结构式如式(Ⅰ)所示的巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成，巯基化透明质酸中半胱氨的接枝率为30％～70％，2.根据权利要求1所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于该复合水凝胶中胶原的含量为4.5～10.5mg/mL，交联巯基化透明质酸的含量为4.5～10.5mg/mL。3.根据权利要求1或2所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶，其特征在于巯基化透明质酸是以透明质酸为基础通过半胱胺改性得到的，作为改性基础的透明质酸的分子量为0.1MDa～3.0MDa。4.权利要求1至3中任一项权利要求所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，其特征在于步骤如下：(1)将结构式如式(Ⅰ)所示且半胱氨的接枝率为30％～70％的巯基化透明质酸溶解于α-MEM培养基中形成浓度为1wt.％～10wt.％的巯基化透明质酸溶液，α-MEM培养基是在α-MEM基础培养基的基础上加入青霉素-链霉素混合液以及抗坏血酸得到，(2)将I型胶原或Ⅱ型胶原用醋酸溶液溶解，调节pH值至7.4～7.8，然后加入PBS缓冲液调节I型胶原或Ⅱ型胶原的浓度为5～20mg/mL得到胶原溶液；(3)将巯基化透明质酸溶液与胶原溶液按照的体积比混匀，调节pH值至7.4～7.8，在34～40℃静置使巯基化透明质酸通过巯基之间形成二硫键的自交联反应形成复合水凝胶。5.根据权利要求4所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶的制备方法，其特征在于所述醋酸溶液的浓度为0.25～1.0mol/L，所述PBS缓冲液的pH值为7.4～7.8、浓度为0.01～0.02mol/L。6.权利要求1至3中任一项权利要求所述可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶在骨修复领域中的应用。7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，将可控自交联巯基化透明质酸-胶原复合水凝胶用于制备软骨组织工...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙勇，樊渝江，陈亚芳，贺萌萌，张兴栋，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：四川,51