一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用技术

本发明专利技术提供一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用，本发明专利技术提供的探针合成步骤简单，光稳定性好。与现有的用于细胞标记的荧光探针相比，该探针能够在复杂体系下专一性的与SNAP标签蛋白结合，标记细胞内的任一蛋白质。该探针还可以应用于细胞内铜离子的检测，随着铜离子浓度的增加，荧光逐渐消失从而达到检测铜离子的作用。本发明专利技术实现了在复杂环境中探针对任一个蛋白质的标记与铜离子的检测作用，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用
本专利技术涉及一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针及其合成方法和应用。
技术介绍
通过小分子荧光探针标记蛋白来研究活细胞中蛋白质的位置、功能、以及蛋白间的通讯，是目前一项先进的技术，被广泛研究。与荧光蛋白相比，蛋白标记技术显示出荧光探针优越的光物理特性、对标记的位置与时间的精准控制。尽管如此，为了达到更高的信号强度、提高信噪比，洗掉未反应的探针分子这一步骤却是必不可少的，从而限制了其对细胞的连续观测。通过标记蛋白标签来标记蛋白的荧光增强型荧光探针不但降低了背景信号，还大幅度提高了信噪比。尽管如此，目前报道的大部分荧光探针存在着一定的局限性。例如，细胞毒性较强的标记配体无法做到活细胞免洗标记；为了达到活细胞免洗蛋白标记，研究人员通常设计基于荧光能量共振转移(FRET)的荧光探针标记到不同的蛋白标签上。尽管如此，大部分探针在标记过程中只能适度的增强荧光，无法达到满意的效果。另外，以FRET为基础的荧光探针一般合成复杂，而较大的分子尺寸则降低了细胞渗透率导致较长的孵育时间。因此，具有高选择性、较快标记速度、较高的荧光开关功能和细胞渗透率的免洗型荧光探针仍然是研究人员探索的目标，作为活细胞内蛋白质的荧光标记被广泛的应用于蛋白质的研究及活细胞成像。本专利技术基于FPET效应设计合成了一个新颖的荧光探针，该探针能够在复杂的细胞环境内快速、专一的与SNAP标签蛋白共价连接从而标记目标蛋白。SNAP标签蛋白能够与O6修饰的苯甲基鸟嘌呤通过亲和反应而共价连接，并以其快速的反应速率、专一的结合能力、以及对细胞的几乎无毒性而被广泛应用于蛋白-蛋白间的通讯研究、药物释放、超高分辨和生物传感器等。本专利技术的目的是合成一个简单的PET型荧光探针，其能够快速专一的与SNAP标签蛋白结合产生荧光增强，而当铜离子存在时，该荧光会逐渐减弱从而实现对铜离子的原位检测应用。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种用于蛋白标记的荧光探针及应用，该探针能够与SNAP-tag蛋白特异性结合并呈现出～510nm处的荧光增强。同时还能原位检测铜离子。本专利技术的另一目的是提供所述蛋白标记的荧光探针的合成方法，该方法具有操作方便、原料廉价、提纯简单等优点。本专利技术提供一种用于荧光标记的荧光探针，以4-(2-(二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酰亚胺为荧光基团，苄氧基为结合位点，荧光探针能够特异性与SNAP蛋白结合并呈现～10倍荧光增强，其在～510nm处显示荧光信号。该荧光探针具有如下结构：其合成路线，如下：操作步骤如下：(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液，将叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，反应4-8h，冷却，倒入冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐；(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠，加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐；(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯，室温搅拌10-16h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(4)中间体4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入2,2-二甲基吡啶胺，加热至50-70℃，反应2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，减压除去溶剂得4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(5)终产物荧光探针的合成：将4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤，加热至80-90℃，3-6h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，减压除去溶剂得荧光探针。步骤(3)中的硅胶柱分离以二氯甲烷为洗脱剂；步骤(4)中的硅胶柱分离以二氯甲烷：甲醇＝200:1-50:1(优选为80:1-20:1)为洗脱剂；步骤(5)中的硅胶柱分离以二氯甲烷：甲醇＝50:1-10:1(优选为40:1-10:1)为洗脱剂。步骤(1)中，4-溴-1,8-萘酐、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、叠氮化钠的质量比为2:(80-25):(1-2)。步骤(2)中，4-叠氮基-1,8-萘酐、乙腈、九水硫化钠的质量比为1:(40-80):(3-8)。步骤(3)中，4-氨基-1,8-萘酐、四氢呋喃、氯乙酰氯的质量比为(5-2.5):(60-80):1。步骤(4)中，4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙腈、2,2-二甲基吡啶胺的质量比为(2-1.2):(60-100):1。步骤(5)中，4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐、乙醇、2-氨基-6-(4-氨甲基)苄氧基-嘌呤的质量比为1:(200-800):(1-1.5)。本专利技术还提供该荧光探针于对细胞内蛋白质的标记及铜离子的原位检测中的应用。本专利技术的有益效果为：本专利技术提供的探针合成原料低价，步骤简单，易纯化，光稳定性好。该小分子荧光探针在PET的淬灭作用下荧光微弱，而在体外检测过程中，其作为底物能与SNAP标签蛋白在温和的条件下共价结合，结合后因嘌呤基团反应掉，PET作用消失而产生荧光，荧光增强约10倍，最大发射波长约为510nm。该类探针在水溶液中荧光微弱，与SNAP-tag蛋白特异性结合之后，～510nm处产生荧光，荧光增强约10倍。这种荧光增强可以排除其他因素的干扰，达到更精准的定位SNAP-tag蛋白。该探针可以应用于细胞内铜离子的检测，随着铜离子浓度的增加，荧光逐渐消失从而达到检测铜离子的作用。与现有的用于细胞标记的荧光探针相比，该探针能够在复杂体系下专一性的与SNAP标签蛋白结合，引入到目标蛋白中，标记细胞内的任一蛋白质，对目标蛋白进行精准的监测。本专利技术实现了在复杂环境中探针对任一个蛋白质的标记与铜离子的检测作用，在生物及医学领域有极其重要的应用价值。附图说明图1本专利技术荧光探针的结构式；图2本专利技术荧光探针合成路线图；图3实施例1制备的荧光探针核磁谱图氢谱；图4实施例1制备的荧光探针核磁谱图碳谱；图5实施例1制备的探针与SNAP蛋白反应前后的MALDI-TOF质谱图；图6实施例1制备的探针与SNAP蛋白反应前后的荧光光谱图，探针浓度为1μM，蛋白浓度为2μM。图7为实施例1制备的探针与SNAP蛋白反应后与各种金属离子的作用情况。图8中实施例1制备的探针与SNAP蛋白反应后，铜离子的滴定光谱图。图9为实施例1制备的探针加入转染了pSNAP-cox8A(NEB)质粒的HEK293细胞中并且加入铜离子后的荧光共聚焦显微镜图像。具体实施方式实施例1：用于蛋白标记的新型荧光探针的合成方法。中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：将4-溴-1,8-萘酐(2.5g，9mmol)置于100mL单口瓶中，加入20mLN,N-二甲基甲酰胺。将叠氮化钠(1.8g，27.7mmol)溶于3.5mL水中并滴加至反应液，加热至100℃，持续6h，冷却，倒入冰水中抽滤，真空干燥得深黄色本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的结构如下：

【技术特征摘要】
1.一种用于细胞内蛋白标记的荧光探针，其特征在于：该荧光探针的结构如下：2.一种权利要求1所述细胞内蛋白标记的荧光探针的合成方法，其特征在于：合成路线为：3.根据权利要求2所述的合成方法，其特征在于：步骤如下：(1)中间体4-叠氮基-1,8-萘酐的合成：4-溴-1,8-萘酐溶于N,N-二甲基甲酰胺(DMF)制成反应液，将叠氮化钠溶于水中，滴加至反应液，加热至90-100℃，反应4-8h，冷却，倒入冰水中抽滤，得4-叠氮基-1,8-萘酐；(2)中间体4-氨基-1,8-萘酐的合成：将4-叠氮基-1,8-萘酐置于乙腈中，并加入九水硫化钠，加热至50-70℃，持续8-20h，冷却，倒入冰水中，抽滤得4-氨基-1,8-萘酐；(3)中间体4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-氨基-1,8-萘酐置于四氢呋喃中，并在冰浴下加入氯乙酰氯，室温搅拌10-16h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，减压除去溶剂得4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(4)中间体4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐的合成：将4-(2-氯乙酰基)氨基-1,8-萘酐置于乙腈中，搅拌下加入2,2-二甲基吡啶胺，加热至50-70℃，反应2-4h，减压除去溶剂，硅胶柱分离，减压除去溶剂得4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐；(5)终产物荧光探针的合成：将4-(2-(2,2-二甲基吡啶胺)乙酰基)氨基-1,8-萘酐溶于乙醇中，搅拌下加入2-氨基-6-(4-...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐兆超，苗露，赵秒，冷双，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁,21