免疫球蛋白GN-糖基的分析方法技术

本发明专利技术提供一种免疫球蛋白G N‑糖基高通量定量、定性分析技术。该技术利用亲水色谱技术提取免疫球蛋白G，利用96孔板对免疫球蛋白糖基进行酶切、标记，利用超高压液相色谱仪对糖基进行检测，利用R软件对糖基数据进行预处理，利用数据库对糖基结构进行鉴定，最终实现糖基的高通量检测以及糖基数据的定量、定性处理。该方法可应用于抗体糖基检测以及生物标志物筛选，并为将来的研究方向提供参考或指引作用。

【技术实现步骤摘要】
免疫球蛋白GN-糖基的分析方法
本专利技术涉及一种免疫球蛋白GN-糖基高通量定量、定性分析技术的领域，更具体的是涉及抗体糖基检测以及生物标志物筛选的领域。
技术介绍
糖基(Glycan)是由单糖通过糖苷键连接形成的完整的糖基结构，N-连接糖基(N-Glycan)是在特异性糖基转移酶(Glycosyltransferases)的作用下，催化单糖从供体转移向糖链，通过氮原子与蛋白质相连接，形成糖苷键，从而形成N-糖基结构。除N-糖基之外，还有通过氧原子与蛋白质相连的糖基(O-连接糖基，O-Glycan)。虽然糖基具有无数种结构形式，但生物体内N-连接的糖基均含有五糖核心结构(3个甘露糖和2个N乙酰葡萄糖胺)，而O-连接的糖基有多种形式，不存在共有的核心结构。糖基化(Glycosylation)是在酶的控制下，在蛋白质或脂质附加上糖类的过程，该过程一般发生在细胞的内质网和高尔基复合体上，N-连接的糖基化(N-linkedGlycosylation)合成起始于内质网，完成于高尔基体，O-连接糖基化(O-linkedGlycosylation)在高尔基体中进行。蛋白质经过糖基化作用，形成糖蛋白。糖基化是对蛋白的重要的修饰作用，有调节蛋白质功能作用。血浆N-糖基水平受基因、体内酶系、高尔基体PH值等多种因素影响，基因虽然不能直接引导糖链的合成，但是基因引导糖基转移酶和糖苷酶的合成，因此，寻找到与糖基相关的基因在筛选疾病易感人群及糖基学改变上具有重要意义。环境因素会影响人体内环境状态，从而影响糖基水平或糖基结构。其中包括：饮食模式、碳水化合物摄入、社会经济学因素、吸烟、饮酒情况等。有研究显示，是否吸烟以及吸烟的年数都会影响血浆糖基组水平。同时，社会经济状态与GP4和GP6存在关联，随着社会经济地位的提高，血浆糖基组GP4、GP6水平会呈现下降趋势。目前也有学者关注于饮食对肠道糖基化水平的影响，推测日常饮食结构会影响机体糖苷含量从而改变免疫状态。糖基化是最普遍、最复杂的蛋白质翻译后修饰，超过半数的所有蛋白，几乎所有的膜蛋白和分泌蛋白都具有糖基结构。糖基化修饰为非模版驱动，所以糖基结构远远比基因和蛋白质结构复杂，因此也造成了糖基组学研究落后于基因组学和蛋白组学研究。糖基化修饰给蛋白质或脂质带来复杂结构的同时，也影响着细胞的表型特征、代谢状态以及细胞生长周期。N-连接糖基化参与细胞的分化、生长、细胞转移、细胞间粘附等等生理过程，在分子与细胞、细胞与细胞的相互作用中起到重要的信号识别、介导作用。糖基对蛋白质分子构象的维持、细胞内转运、体内的稳定性和活性方面据具有重要作用。在免疫系统中，糖基参与构成细胞表面抗原、介导免疫反应等生物学功能。信号转导中，糖基参与细胞间识别。因此，在炎症、自身免疫性疾病、衰老、癌症过程中，均有糖类物质的介导，糖基在疾病标志物的筛选方面具有广阔的发展前景：1.肿瘤标志物的应用在不同类型的肿瘤患者的肿瘤组织、血清中均发现与肿瘤的发生、发展有显著关联的糖基修饰改变、或者糖基化水平改变。凝集素相关糖蛋白与乳腺癌、结直肠癌存在关联。肝纤维化、肝硬化以及肝癌的病理过程均与蛋白质糖基化修饰的改变有关。2.在炎症相关疾病的应用大多数急性期蛋白是糖蛋白，这些蛋白血清水平的改变以及蛋白所连接的糖基改变导致慢性炎症。风湿性关节炎与很多血清糖蛋白以及急性期蛋白的糖基化修饰改变有显著关联。3.慢性非传染性疾病中应用糖基化修饰与人体能量代谢有密切关系，糖基化修饰可能导致机体能量代谢紊乱，从而导致血糖、血脂等指标的改变，甚至引起慢性疾病。有研究发现N-糖基的血浆水平与血浆总胆固醇、高密度脂蛋白有显著关联。也有研究发现。糖基水平的变化与高血压、肥胖、糖尿病等疾病存在关联。糖基组学研究的进步，使未来糖基结构的异常或糖基水平的改变作为疾病生物标志物，探寻疾病治疗靶点提供科学依据。蛋白质糖基化是沟通蛋白质和糖这二大类生物大分子的桥梁。在蛋白质组学水平进行蛋白质糖基化研究有助于全面深刻地认识蛋白质糖基化发生、发展的规律及其在整个生命过程中的生物学意义,有助于从基因组-蛋白组-糖组这样一个宏观的综合的层面上观察分析生命现象,达到对生命现象更本质的认识,进而有助于发病机制的阐明,为疾病的早期诊断、治疗等提供更科学的指导。作为一类重要的信息中介分子,糖只有与其他诸如蛋白质、脂类的糖基化等放在一起研究才更接近其本质含义。免疫球蛋白(Immunoglobulins,Igs)是一组具有抗体活性的可溶性糖蛋白，其包含IgA、IgD、IgE、IgG、IgM五类，其中IgG是人体血清中含量最多的免疫球蛋白，约占人体血清Ig的80％以上，是再次免疫应答后形成抗体的主要成分，在机体中发挥重要作用。它是由2条轻链和2条重链构成的“Y”字型结构，可水解为抗原结合段(Fab段)和结晶段(Fc段)，其Fc段297位氨基酸残基上连接有N-糖基，N-糖基的改变可以引起Fc段构象的改变，从而影响IgG与Fc受体的亲和力，最终影响IgG的效应功能。IgG效应功能的改变参与了多种疾病的病理过程。有研究发现，IgGN-糖基唾液酸化下降，能够增加IgG与免疫细胞上的Fc受体(FcγRIIIa)的亲和力，从而增加免疫复合物与免疫细胞的相互作用，加重炎症反应，反之，唾液酸化修饰升高，IgG与Fc受体结合减弱，就能调控IgG从促炎效应像抗炎效应转变。如果利用糖苷酶水解IgGN-糖基，能够有效减少免疫复合物的沉积，从而达到治疗SLE的效果。同时，IgGN-糖基化修饰也在抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用(antibody-dependentcell-mediatedcytotoxicity，ADCC)中起到重要作用，当IgGN-糖基缺少核心岩藻糖基修饰时，增强ADCC，导致自身免疫性疾病的发生，反之增加核心岩藻糖基修饰可以导致ADCC下降，从而核心岩藻糖基修饰的单克隆抗体已经成为SLE免疫治疗的靶点之一。在一项多种族的IgGN-糖基与高血压的关联研究中，王友信(Wangetal,Medicine,2016)等人发现在高血压人群或高血压前期人群中，5种糖基结构的水平明显改变，而且这5种糖基结构与收缩压与舒张压具有显著的关联。在一项以社区人群为基础的研究中，于鑫玮(Yuetal,Medicine,2016)发现IgGN-糖基能够有效预测机体生物年龄，该研究提示IgGN-糖基可能参与机体的老化过程。在IgGN-糖基与类风湿性关节炎(RheumatoidArthritis,RA)的研究中，Sebastian等人(Sebastianetal,OMICS,2016)发现IgGN-糖基中的4种糖基结构的水平在RA患者中显著改变，其中一种糖基结构能够有效预测RA的发生，该研究提示IgGN-糖基化可能参与自身免疫疾病的病理过程。蛋白质糖基化研究，目前已经成为国际研究热点，但是由于糖基化不同于多肽链的合成，不受DNA的直接控制，而是由糖基化相关的几种酶协调作用完成的，受各种生理生化条件的影响很大，造成即使同一个位点也会有糖基化程度不同的产物。这种糖基化程度的不同，使同一肽链因所带糖基的不同而呈现多种多样的结构，糖基化的多样性给糖蛋白的分离分析带来了很大的困难。首先，不同糖型的同一糖蛋白会在电泳上呈本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种免疫球蛋白的N‑糖基结构的高通量测定的方法，步骤包括：(1)血浆免疫球蛋白G提取：从血浆中通过真空提取装置提取和纯化免疫球蛋白IgG；(2)N‑糖基切除：通过肽N糖苷酶F(PNGase)对N‑糖基进行特异性切除；(3)N‑糖基荧光标记：利用2‑氨基苯甲酰胺(2‑AB)对切除的N‑糖基进行荧光标记；(4)UPLC糖基检测：设置UPLC糖基检测流动相以及糖链检测条件，对溶解的样本进行检测，并汇总所检测样本的色谱峰进行积分判峰，并保存每个峰的保留时间、峰面积、峰面积百分比、峰高度；(5)糖基峰结构鉴定数据预处理：将原始采集的峰面积转化为糖基百分含量，并对所得N‑糖数据进行批次效应校正，同时筛选和剔除离群值；(6)构建待测样本的N‑糖基图谱：将所得的糖基峰，利用GlycanR数据程序计算糖基衍生变量，得到待测样本的N‑糖基图谱；(7)N‑糖基结构鉴定：将所得待测样本的N‑糖基图谱，与中国人糖基标准图谱及其相关数据库进行比较，从而确定待测样本的免疫球蛋白的N‑糖基结构。

【技术特征摘要】
1.一种免疫球蛋白的N-糖基结构的高通量测定的方法，步骤包括：(1)血浆免疫球蛋白G提取：从血浆中通过真空提取装置提取和纯化免疫球蛋白IgG；(2)N-糖基切除：通过肽N糖苷酶F(PNGase)对N-糖基进行特异性切除；(3)N-糖基荧光标记：利用2-氨基苯甲酰胺(2-AB)对切除的N-糖基进行荧光标记；(4)UPLC糖基检测：设置UPLC糖基检测流动相以及糖链检测条件，对溶解的样本进行检测，并汇总所检测样本的色谱峰进行积分判峰，并保存每个峰的保留时间、峰面积、峰面积百分比、峰高度；(5)糖基峰结构鉴定数据预处理：将原始采集的峰面积转化为糖基百分含量，并对所得N-糖数据进行批次效应校正，同时筛选和剔除离群值；(6)构建待测样本的N-糖基图谱：将所得的糖基峰，利用GlycanR数据程序计算糖基衍生变量，得到待测样本的N-糖基图谱；(7)N-糖基结构鉴定：将所得待测样本的N-糖基图谱，与中国人糖基标准图谱及其相关数据库进行比较，从而确定待测样本的免疫球蛋白的N-糖基结构。2.权利要求1的方法，其中步骤(1)通过96孔ProteinG提取板将血浆或血清IgG提取至2mL96孔收集板中，并通过Nanodrop8000测定蛋白浓度后，取出约300μLIgG溶液(约150μgIgG)于1.1mL96孔深孔板中整板挥干。3.权利要求1的方法，其中步骤(2)中在深孔板中加入变性剂变性蛋白后调节溶液pH至8.0，加入糖苷酶或切糖酶进行切除糖链。4.权利要求3的方法，其中所述变性剂为SDS溶液，并在60℃变性反应10min，或变性剂为Igepal溶液，并在室温变性反应1...

【专利技术属性】
技术研发人员：戈丹·劳克，玛雅·普希奇宫巴克维奇，福拉诺·黄片，王嵬，
申请(专利权)人：中科亚美医学科技北京有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11