一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法，本发明专利技术针对白芍存在的质量控制问题，分别建立了含硫白芍HPLC特征图谱和无硫白芍HPLC特征图谱，同时采用高效液相色谱‑质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，采用本发明专利技术建立的白芍的HPLC特征图谱鉴别白芍熏硫后产生的芍药苷亚硫酸酯产物来判断白芍药材是否经硫磺熏蒸，其与常规的二氧化硫检测方法相比，该方法简单、灵敏度高、专属性强、重现性好，可以用于白芍熏硫与否的检测，可以较全面、准确快速鉴别白芍的真伪及品质优劣，尤其适合白芍规模化生产的检测和鉴别。

【技术实现步骤摘要】
一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法
本专利技术属于中药鉴别领域，具体涉及一种白芍HPLC特征图谱的构建及其检测方法。
技术介绍
硫磺熏蒸中药材是我国中药材的传统加工方法之一，通过适量的硫磺熏蒸，可以达到防霉、防虫、防潮、延长药材储存时间的目的。但是，大量研究表明，硫熏通常会使中药材的有效成分明显降低，更重要的是硫熏后残留在中药饮片的硫化合物对人体健康有害，甚至在人体内转化为致癌物亚硝胺。白芍是中药处方中常用的一味养肝补血药，有传统加工方法为芍药根经去皮水煮后硫磺熏制再干燥。目前白芍的产地初加工方法主要采用水煮至透心后晒干，但由于煮后不易晒干、且容易发霉，因此药农普遍采用硫磺熏蒸，尤其在安徽亳州等白芍主产区，约50％的白芍均采用硫磺熏蒸方法，而且至少要熏蒸2～3次，这样处理后白芍不易霉变，晒干后易于储存。有学者通过利用HPLC检测市售的22批白芍饮片，探讨市售白芍饮片低于药典标准的原因，结果显示硫磺熏蒸是导致市售白芍饮片质量改变的原因。在调配时常发现白芍饮片有一股刺激性气味，市场白芍饮片抽检常出现含硫量超标现象。白芍炮制过程中，因硫磺熏蒸后可使部分芍药苷转变成为新成分芍药苷亚硫酸酯，从而使芍药苷的含量降低。因此，要避免使用硫磺熏蒸，减少有效成分芍药苷的流失。而白芍药材中含硫量的测定方法一般采用2015版中国药典规定的酸碱滴定法，该方法操作较为繁琐，且检测灵敏度相对较低。因此，非常有必要建立一种快速、灵敏度高的用于白芍的真伪鉴别及熏硫鉴别的检测方法。
技术实现思路
为了克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，该方法重现性良好，准确可靠，通过所建立的白芍HPLC特征图谱可以实现对白芍是否熏硫及相关伪品全面而有效的鉴别。本专利技术是通过以下技术方案实现：一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，包括如下步骤：(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；(b)供试品溶液的制备：取含硫和无硫白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1％磷酸溶液为流动相按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；(d)含硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与含硫供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立含硫白芍对照特征图谱，确定具有7个特征峰，峰1～6分别与参照物峰相对保留时间一致，7个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷、峰7为芍药苷亚硫酸酯；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.24、0.67、0.87、1.00、1.48、1.85、0.58，其相对保留时间应在规定值的±10％内；且峰7相对峰面积≥0.003。(e)无硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立无硫白芍对照特征图谱，确定具有6个特征峰，峰1～6分别与参照物峰相对保留时间一致，6个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.25、0.70、0.90、1.0、1.60、2.21，其相对保留时间应在规定值的±10％内，且在相对保留时间为0.58±5％位置出现的色谱峰相对峰面积应＜0.003。优选的，所述(b)中，含硫白芍样品中二氧化硫的含量大于0小于400mg/kg，符合2015版中国药典规定。优选的，本专利技术的白芍UPLC特征图谱的构建方法中还包括步骤(f)色谱峰的指认：通过高效液相色谱-质谱联用分析方法对含硫白芍与无硫白芍进行成分的分析与指认，通过对一级质谱与二级质谱图谱的分析及文献报道，确定含硫白芍中多于无硫白芍的色谱峰7为芍药苷亚硫酸酯。峰7芍药苷亚硫酸酯的存在，是鉴别白芍熏硫与否的标志。其中，所述高效液相色谱-质谱联用分析方法中，色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈为流动相A和0.1％甲酸为流动相B按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：0.40ml/min；柱温：30℃；质谱条件：MRM多反应监测扫描模式：负离子模式下采集，扫描模式为MRM多反应监测模式，分析物的检测离子对：m/z543.10/421.01；扫描时间：6.00-9.00min；锥孔电压：20V；碰撞能：40V；MS全扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；扫描检测：m/z300-650；锥孔电压：20V；二级扫描：负离子模式下采集，扫描时间：6.00-9.00min；检测离子：m/z507.00；扫描检测：m/z100-500；锥孔电压：20V；碰撞能：40V。本专利技术利用上述建立的含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱，提供了一种白芍的质量检测方法，包括如下步骤：(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；(b)供试品溶液的制备：取白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1％磷酸溶液按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；(d)鉴别：分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，测定，即得白芍供试品的特征图谱，将白芍供试品的特征图谱与含硫白芍对照特征图谱和无硫白芍对照特征图谱进行比较，若白芍供试品的特征图谱与所建立的含硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置出现的色谱峰相对峰面积≥0.003，则判断供试品为熏硫白芍样品；若白芍供试品特征图谱与所建立的无硫白芍对照特征图谱标准相符，在相对保留时间为0.58±5％位置的出现的色谱峰相对峰面积＜0.003，则判断供试品为无硫白芍样品；若均不符合，则为白芍伪品。本专利技术与现有技术相比，具有如下有益效果：本专利技术针对白芍存在的质量控制问题，分别建立了含硫白芍HPLC特征图谱和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6‑五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6‑五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；(b) 供试品溶液的制备：分别取含硫和无硫白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30‑45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(c) 色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；

【技术特征摘要】
1.一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(a)混合对照品溶液的制备：取没食子酸、儿茶素、芍药内酯、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、苯甲酰芍药苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含没食子酸50μg、儿茶素30μg、芍药内酯100μg、芍药苷160μg、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖30μg、苯甲酰芍药苷30μg的混合对照品溶液，摇匀，即得；(b)供试品溶液的制备：分别取含硫和无硫白芍样品0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理30-45分钟，放冷，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；(c)色谱条件与系统适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%磷酸溶液为流动相按下表中的规定进行梯度洗脱；流速：1.0ml/min；柱温为30℃；检测波长为230nm；（d）含硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与含硫供试品溶液各10µl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立含硫白芍对照特征图谱，确定具有7个特征峰，峰1~6分别与参照物峰相对保留时间一致，7个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷、峰7为芍药苷亚硫酸酯；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.24、0.67、0.87、1.00、1.48、1.85、0.58，其相对保留时间应在规定值的±10%内；且峰7相对峰面积≥0.003；（e）无硫白芍对照特征图谱的建立：分别精密吸取混合对照品溶液与无硫供试品溶液各10µl，注入高效液相色谱仪，测定，采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”，建立无硫白芍对照特征图谱，确定具有6个特征峰，峰1~6分别与参照物峰相对保留时间一致，6个特征峰分别为：峰1为没食子酸、峰2为儿茶素、峰3为芍药内酯、峰4为芍药苷、峰5为1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖、峰6为苯甲酰芍药苷；以峰4芍药苷峰为参照峰，各特征峰的相对保留时间分别为：0.25、0.70、0.90、1.0、1.60、2.21，其相对保留时间应在规定值的±10%内，且在相对保留时间为0.58±5%位置出现的色谱峰相对峰面积应＜0.003。2.根据权利要求1所述的一种白芍UPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，所述（b）中，含硫白芍样品中二氧化硫的含量大于0小于400mg/kg。3.根据权利要求1所述的一种白芍HPLC特征图谱的构建方法，其特征在于，还包括步骤（f）色...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁青，朱德全，刘桂联，霍文杰，潘礼业，
申请(专利权)人：广东一方制药有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44