一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法技术

本发明专利技术公开了一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下：用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示等。本发明专利技术实现PAH基因全覆盖，所检测的序列长度达88171bp，有助于内含子内变异和结构变异的检测，可提高致病突变的检出率，而且操作更为简单，成本低，另外每个扩增片段与相邻片段均有重叠区，可用于片段拼接和单体型构建。

【技术实现步骤摘要】
一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及PAH基因
，特别涉及一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法。
技术介绍
苯丙氨酸羟化酶缺乏症（phenylalaninehydroxylasedeficiency,PAHD）是常见的氨基酸代谢病，PAHD的发病是由于苯丙氨酸羟化酶（phenylalaninehydroxylase,PAH）突变导致酶活性降低或丧失，使苯丙氨酸代谢异常。未经治疗的PAHD患儿由于体内过量的苯丙氨酸和旁路代谢产物的神经毒性作用可造成严重的智力障碍和症状性癫痫。如果能得到早期诊断和治疗，则神经损伤则可不发生，智力正常。随着临床诊治的发展，PAHD已成为可治疗、可预防的疾病。由于患儿在早期不出现症状，PAH基因突变分析是PAHD的确诊方法。同时，对患者进行PAH基因检测也有助于其直系亲属遗传咨询，并为再次生育产前检测提供依据。PAH基因位于人染色体位置12q23.2，全长约90kb，含13个外显子，编码区长度为1359bp，编码452个氨基酸的多肽链并进一步折叠构成苯丙氨酸羟化酶蛋白。目前报道的PAH基因突变种类多，约有800多种，大部分为错义突变，其余还包括剪切突变、无义突变和小的缺失/插入突变，涉及整个基因，具有高度遗传异质性，存在显著的地区和人种差异。同时，国内外学者均有报道PAH基因突变部分存在跨越外显子和/或内含子的大片段缺失或重复突变。目前采用PCR扩增外显子及侧翼有限区域序列结合DNA测序的方法可明确90%左右的患者，仍有10%左右的患者不能明确病因，因此亟需能够特异性检测PAH全长基因的检测方法。自1986年DiLella等人使用片段克隆-Sanger核苷酸测序方法检测出人类PAH基因的第一个致病突变之后，国内外出现越来越多分子检测技术用于PAH基因的突变检测。已报道的基因检测方法有聚合酶链反应-等位基因特异性寡核苷酸链杂交（Polymerasechainreaction--allelespecificoligonucleotides,PCR-ASO）、聚合酶链反应-变性凝胶梯度电泳（PCR-denaturinggradientgelelectrophoresis,PCR-DGGE）、聚合酶链反应-单链构象多态性（PCR-Singlestrandconformationpolymorphism,PCR-SSCP）、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（PCR-restrictionfragmentlengthpolymorphism,PCR-RFLP）、聚合酶链反应-变性高效液相色谱（PCR-denaturinghigh-performanceliquidchromatography,PCR-DHPLC）、聚合酶链反应-高分辨率熔解曲线分析（PCR-highresolutionmelting,PCR-HRM）等，有着操作简单经济适用等特点，但其缺点是仅能检出有限的特定突变型或无法明确突变的具体位置和类型。目前，Sanger测序方法是临床应用于PAH基因突变检测的主要方法。2006年张志等（经典型苯丙酮尿症基因全长外显子的突变检测和分析，《中国优生与遗传杂志》，2006年，第14卷第5期，14-16页）建立了对PAH基因外显子PCR扩增产物Sanger测序的方法。2007年宋昉等（中国北方地区苯丙氨酸羟化酶基因的突变构成，《中华医学遗传学杂志》，2007年，第24卷第3期，241-246页）使用张志等人建立的分析方法对230例苯丙酮尿症患儿PAH基因全部外显子及其侧翼内含子序列进行了Sanger测序检测。针对PAH基因突变检测，已有多项专利公开报道。CN1335408A（2002年）公布了适合于早期诊断和产前筛查苯丙酮尿症的PAH基因突变诊断专用DNA芯片，但该方法仅对40种PAH基因突变进行检测。CN1696308A（2005年）也公布了适合于早期诊断和产前筛查苯丙酮尿症的PAH基因突变诊断专用DNA芯片，但该方法仅对6种PAH基因突变进行检测。CN101481741A（2009年）公布了利用特异性扩增PAH基因的第4、5、6、7、10、11和12号外显子及其侧翼内含子序列的PCR引物，再结合Sanger测序法、酶促错配切割等方法检测13种PAH基因突变。CN101570787A（2009年）也公布了一种用于产前快速诊断的复合芯片，但该方法仅对5种PAH基因突变进行检测。CN101899518A（2010年）公布了一种检测苯丙酮尿症PAH基因7个热点突变位点的试剂盒及其PCR扩增方法，因其产物的特异性非常高，可直接观察凝胶电泳的产物条带的有无来判断PAH基因相应突变位点的基因型。CN101693921A（2010年）公布了一种针对口腔拭子DNA，利用特异性PCR扩增PAH基因第7号和第12号外显子，再经Sanger测序技术检测这两个外显子的突变情况。CN201376967Y（2010年）公布了用于产前快速诊断的复合芯片，但该方法仅对5种PAH基因突变进行检测。CN102533992A（2012年）公布了一种对苯丙氨酸羟化酶基因进行测序的方法，即同时对PAH基因的第1至13号外显子的目标区域进行特异性PCR扩增，其PCR产物用于构建测序文库，再进行高通量测序。CN202671546U（2013年）公布了一种苯丙酮尿症致病基因突变检测试剂盒，即利用特异性PCR引物扩增PAH基因的13个外显子，再使用Sanger测序进行突变分析。CN103436616A（2013年）公布了一种同时检测中国人群苯丙酮尿症PAH基因12个突变热点的试剂盒，适合于群体性筛查。CN104031990A（2014年）公布了一种苯丙酮尿症PAH基因检测试剂盒，主要检测PAH基因的13个常见突变位点。CN103509865A（2014年）公布了一种利用高分辨熔解曲线分析技术检测PAH基因突变的方法，主要可检测PAH基因第3、6、7、11和12号外显子的序列是否存在异常，但无法检出具体的基因型。CN104232770A（2014年）公布了一种苯丙酮尿症基因检测试剂盒，该试剂盒利用多重连接检测反应技术快速检测PAH基因7个位点的基因型。CN105177160A（2015年）公布了一种检测多种新生儿遗传代谢病致病基因突变的引物及试剂盒，对22种常见新生儿遗传代谢病相关40个致病基因（包含PAH基因）的外显子及外显子内含子结合区域的序列进行特异性引物多重PCR，而后进行二代测序和分析，给出检测基因的突变信息。CN105755109A（2016）公布了一种新的苯丙酮尿症基因筛查和诊断体系及试剂盒，利用PCR技术、DNA连接技术和毛细管电泳技术所构建的体系，对41个较常见的PAH基因突变位点进行检测。PAH基因外显子总长度为4122bp（参考基因组为GRCh37/hg19），而内含子总长度却高达76597bp（参考基因组为GRCh37/hg19），上述报道技术只针对突变位点进行检测，或检测PAH基因外显子序列和少部分位于外显子侧翼的内含子序列，而不能针对PAH基因全部内含子序列进行检测，本领域仍需要一种能够检测PAH基因全长的基因检测方法，即该方法不仅能够检本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，其特征在于，用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下：用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，其正向引物如SEQ ID NO:1所示，反向引物如SEQ ID NO:2所示；用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:3所示，反向引物如SEQ ID NO:4所示；用于扩增PAH基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQ ID NO:5所示，反向引物如SEQ ID NO:6所示；用于扩增PAH基因内含子3上游（内含子5’端）到内含子3下游（内含子3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:7所示，反向引物如SEQ ID NO:8所示；用于扩增PAH基因内含子3到内含子4的引物，其正向引物如SEQ ID NO:9所示，反向引物如SEQ ID NO:10所示；用于扩增PAH基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQ ID NO:11所示，反向引物如SEQ ID NO:12所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子7的引物，其正向引物如SEQ ID NO:13所示，反向引物如SEQ ID NO:14所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子11的引物，其正向引物如SEQ ID NO:15所示，反向引物如SEQ ID NO:16所示；用于扩增PAH基因内含子9到外显子13下游外侧序列（位于基因3’端）的引物，其正向引物如SEQ ID NO:17所示，反向引物如SEQ ID NO:18所示；用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的试剂盒，包含引物组中的一对或多对引物。...

【技术特征摘要】
1.一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，其特征在于，用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的引物组，该组PCR引物共9对，分别如下：用于扩增PAH基因外显子1上游外侧序列（位于基因5’端）到内含子2的引物，其正向引物如SEQIDNO:1所示，反向引物如SEQIDNO:2所示；用于扩增PAH基因内含子2上游（5’端）到内含子2下游（3’端）的引物，其正向引物如SEQIDNO:3所示，反向引物如SEQIDNO:4所示；用于扩增PAH基因内含子2到内含子3的引物，其正向引物如SEQIDNO:5所示，反向引物如SEQIDNO:6所示；用于扩增PAH基因内含子3上游（内含子5’端）到内含子3下游（内含子3’端）的引物，其正向引物如SEQIDNO:7所示，反向引物如SEQIDNO:8所示；用于扩增PAH基因内含子3到内含子4的引物，其正向引物如SEQIDNO:9所示，反向引物如SEQIDNO:10所示；用于扩增PAH基因内含子4到内含子5的引物，其正向引物如SEQIDNO:11所示，反向引物如SEQIDNO:12所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子7的引物，其正向引物如SEQIDNO:13所示，反向引物如SEQIDNO:14所示；用于扩增PAH基因内含子5到内含子11的引物，其正向引物如SEQIDNO:15所示，反向引物如SEQIDNO:16所示；用于扩增PAH基因内含子9到外显子13下游外侧序列（位于基因3’端）的引物，其正向引物如SEQIDNO:17所示，反向引物如SEQIDNO:18所示；用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的试剂盒，包含引物组中的一对或多对引物。2.根据权利要求1所述的一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述用于PCR特异性扩增检测PAH基因突变的试剂盒还包含一种或多种试剂，利用所述引物进行长链PCR“long-rangePCR,LR-PCR”反应的试剂；利用所述引物进行长片段PCR反应的试剂DNA聚合酶、缓冲液和dNTP混合物；用于处理扩增产物以使得扩增产物能用于高通量测序技术中的试剂。3.根据权利要求2所述的一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，其特征在于：所述试剂盒包含下述试剂，PCR引物组中的一对或多对引物、10×GeneAmpHighFidelityPCR缓冲液、10mmol/LdNTP、5mol/L甜菜碱、DMSO和5U/μL聚合酶混合物。4.根据权利要求3所述的一种检测PAH基因突变的扩增引物、试剂盒及其检测方法，其特征在于：在总体积为50µl的PCR反应体系中含有下述组分：每种PCR引物各1μl，引物的浓度为10μmol/L；10×GeneAmpHighFidelityPCR缓冲液5μl，10mmol...

【专利技术属性】
技术研发人员：许争峰，马定远，刘刚，
申请(专利权)人：南京市妇幼保健院，
类型：发明
国别省市：江苏,32