本发明专利技术公开了硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用，属于植物基因工程领域。OsNRT1.9b基因编码蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术通过构建水稻OsNRT1.9b基因超表达植株、OsNRT1.9a基因的突变体植株，发现通过提高OsNRT1.9b基因表达，可以使正常的水稻分蘖数和每株穗数增加，单株灌浆粒数和单株产量增加，因此OsNRT1.9b基因可用于水稻选育中以提高水稻产量。OsNRT1.9b基因在阐述氮素影响植物生长及发育过程方面以及在水稻株型改良方面具有重要的应用价值。
Application of nitrate transporter gene OsNRT1.9b in rice breeding
The invention discloses the application of nitrate transporter gene OsNRT1.9b in rice breeding, and belongs to the field of plant genetic engineering. The amino acid sequence of the OsNRT1.9b gene encodes a protein, such as SEQ ID ID NO.1, showing cDNA sequences such as SEQ ID ID NO.2. By constructing the mutant plant of rice OsNRT1.9b gene overexpressing plant and OsNRT1.9a gene, it is found that by improving the expression of OsNRT1.9b gene, the number of normal rice tillering and per plant can increase, the number of grain filling grain and yield per plant increase. Therefore, the OsNRT1.9b base can be used in rice breeding to improve rice. Output. OsNRT1.9b gene has important application value in explaining the effects of nitrogen on plant growth and development, as well as in improving rice plant type.
【技术实现步骤摘要】
硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用
本专利技术属于植物基因工程领域，具体涉及硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用。
技术介绍
中国水稻种植面积占世界作物总种植面积的20％，但氮肥施用量却占到世界总施用量的37％；1995年中国氮肥生产量和使用量已达世界第一位，但氮肥使用效率较低，氮肥的施用量已较50年前增长20倍，按这种趋势，预计到2050年，将会再翻3倍。氮肥施用过量会导致水体富营养化等生态污染问题[徐国华，范晓荣.水稻硝转运蛋白基因OsNRT1.1b和OsNRT1.1b的功能研究.南京农业大学，2011：4-6]。更多的氮素营养通过反硝化作用、水土流失、自然挥发、微生物利用等途径遭到浪费。如果将氮素的吸收效率提高1％，就相当于每年节约了十多亿美元的开支。从中国国情分析，扩大种植面积提高总产量的潜力已经很有限，唯一的出路是在有限的土地上生产出更多的稻谷，即提高单位面积产量。在过去的传统耕作中，通过选择氮利用效率更高的作物，来提高氮的利用效率；但与分子水平上的育种相比，这个过程显得缓慢而低效[张洪程，戴其根.水稻氮素利用的基因型差异与生理机理研究.扬州大学，2008：10-13]。要提高氮利用率，必须从氮的分子吸收机制中寻找突破口。硝酸根运输基因家族分为低亲和力硝酸根运输基因与高亲和力硝酸根运输基因两类[周诗毅.糖类和氨基酸对水稻诱导型高亲和力硝酸盐转运系统的影响.华中科技大学，2009：15-16]。通过氮同化作用，将硝态氮和铵态氮吸收并转化为氨基酸，称为氮的第一类吸收。通过对氮的运输使种子营养物质增加，增加饱满度，称为氮的第二类吸收，也就是氮的再利用[KbntS,BiY,StevenJ,etal.Understandingplantresponsetonitrogenlimitationfortheimprovementofcropnitrogenuseefficiency.JournalofExperimental,2011,62(4):1499-1509]。增加氮吸收积累量或氮转运量，都可以增产。因此，在现代化农业建设中，通过分子育种手段来提高水稻对氮肥的利用效率，可以减少氮肥污染，还能增加产量。NRT1/PTR家族(NRT1/PTRfamily,NPF)是指能够介导2-3个氨基酸残基的小分子肽及硝酸根等物质进行跨膜运输的蛋白[RentschD,SchmidtS,TegederM.Transportersforuptakeandallocationoforganicnitrogencompoundsinplants.FEBSLet,2007,581:2281-2289]。NRT1/PTR家族成员参与了种子形成过程中蛋白质的积累和萌发中蛋白降解后小分子多肽形式转运[MartreP,PorterJR,JamiesonPD,etal.Modelinggrainnitrogenaccumulationandproteincompositiontounderstandthesink/sourceregulationsofnitrogenremobilizationforwheat.PlantPhysiol,2003,133:1959-1967]。目前关于NPF家族成员研究的报道很少，本专利技术涉及的OsNRT1.9基因是水稻NPF基因家族的一个硝酸根运输同源基因。本专利技术发现OsNRT1.9基因转录后加工能形成两种剪接，其中第二种剪接形式OsNRT1.9b对水稻分蘖有非常重要的作用，可应用于植物株型改良从而使水稻增产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于解决现有技术中存在的问题，提供水稻NPF基因家族成员硝酸根运输基因OsNRT1.9b在水稻选育中的应用。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：本专利技术以水稻的NPF基因家族成员硝酸根运输基因OsNRT1.9b为对象，从水稻中花11中克隆了OsNRT1.9b的cDNA序列。通过构建OsNRT1.9b基因超表达载体，采用农杆菌EHA105介导的遗传转化方法，将超表达载体导入正常粳稻品种中花11中，得到OsNRT1.9b基因超表达植株，其分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与对照野生型中花11相比显著提高。通过CRISPR技术构建OsNRT1.9b基因敲除载体，将敲除载体导入中花11中，得到OsNRT1.9b基因的突变体植株，突变体植株的分蘖数、有效穗数、灌浆籽粒数和产量与中花11相比显著降低。这些结果表明，通过提高OsNRT1.9b基因的表达，可以使正常的水稻分蘖数增加，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。基于本专利技术发现的OsNRT1.9b基因的功能，OsNRT1.9b基因可用于水稻选育中。所述的水稻选育为提高水稻分蘖数，从而提高穗数、灌浆粒数和水稻产量。具体可通过提高OsNRT1.9b基因的表达使水稻分蘖数和每株穗数、灌浆粒数增加，达到提高水稻产量的目的。OsNRT1.9b基因也可用于提高其他植物的产量，如通过转基因使OsNRT1.9b基因在植物中(超量)表达，来提高植物的分枝数量，进而使植物的产量得到提高。所述的植物是指单子叶植物或双子叶植物；如：小麦、番茄、草坪草或苜蓿等。所述的OsNRT1.9b基因编码的OsNRT1.9b蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述的OsNRT1.9b基因的cDNA序列优选如SEQIDNO.2所示。应该理解为，在不影响OsNRT1.9b蛋白活性的前提下(即不在蛋白的活性中心)，本领域技术人员可对SEQIDNO.1所示的氨基酸序列进行各种取代、添加和/或缺失一个或几个氨基酸获得具有同等功能的氨基酸序列。因此，OsNRT1.9b蛋白还包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸获得的具有同等活性的蛋白质。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。本专利技术的优点和效果：(1)本专利技术克隆的OsNRT1.9b基因超表达后使水稻分蘖能力增强，说明OsNRT1.9b基因对提高水稻产量较明显，因此，通过基因工程技术提高OsNRT1.9b基因的表达能够提高植物产量。这不仅有助于通过正常施氮条件下培育高产水稻，还可以通过分子育种进行植物的品种改良。(2)OsNRT1.9b基因的成功克隆，进一步证实了NPF家族在氮吸收过程中的重要作用，对阐明NPF家族的生物学功能有重要的意义，另外对进一步了解植物氮代谢途径，提高氮吸收效率有极大的推动作用。(3)尽管目前已克隆到了一些提高植物产量的基因，但对植物增产的分子机制仍不清楚。而本专利技术克隆的OsNRT1.9b基因能够提高水稻的产量，对确定植物增产的关键因素有极大的推动作用。附图说明图1是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株的整株表型图。图2是对照中花11、OsNRT1.9b基因超表达植株3个株系、OsNRT1.9b基因突变体植株分蘖数的统计柱状图，数据采用SPSS软件进行变量分析(ANOVA)，使用Duncan’s在0.05、0.01和0.001三个水平上进行差异显著性分析，与对照相比分别用*、**和***表示。图3是对照中花本文档来自技高网...
【技术保护点】
OsNRT1.9b基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数。
【技术特征摘要】
1.OsNRT1.9b基因在水稻选育中的应用，其特征在于：所述的水稻选育为提高水稻分蘖数。2.OsNRT1.9b基因在提高水稻穗数中的应用。3.OsNRT1.9b基因在提高水稻灌浆粒数中的应用。4.OsNRT1.9b基因在提高水稻产量中的应用。5.OsNRT1.9b基因在提高植物产量中的应用。6.根据权利要求1-5任一项所述的应用，其特征在于：通过提高OsNRT1.9b基因的表达实现所述应用。7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的植物指单子叶植物或双子叶植...
【专利技术属性】
技术研发人员：方中明，黄玮婷，汪杰，朱炜，吕凯，
申请(专利权)人：武汉生物工程学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42
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