一种白花虎眼万年青Qt DCAF8基因及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种白花虎眼万年青Qt DCAF8基因及应用，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，该基因编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；该基因能够应用在植物珠芽和叶片再生发育机理以及培育叶形奇特的花卉植物新品种分子育种中，具有很好的应用前景。

A kind of Qt DCAF8 gene and its application

The present invention discloses a kind of Qt DCAF8 gene and its application. Its nucleotide sequence, such as SEQ ID NO.1, shows the amino acid sequence of the protein encoded by the gene, such as SEQ ID NO.2, which can be applied to the mechanism of plant bud and leaf regeneration and the new species of flower plants with peculiar leaf shape. In breeding, it has a good application prospect.

【技术实现步骤摘要】
一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用
本专利技术属于植物基因工程
，具体地说，涉及一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用。
技术介绍
鳞茎球根花卉是指其植株地下部分的茎或根变态、膨大并贮藏大量养分的一类多年生草本植物，包括百合、郁金香、风信子和番红花等，多数均具有较高的观赏、药用、经济和生态价值，具有抗逆性强、适应范围广、易栽培管理等优点，但是其繁殖方式绝大多数均为为“老球上长新球”，形成对老球的严重依赖，并且品种优良性状难以持续保持下来，繁殖系数低、再生困难和种球生活力不断退化等问题已经成为制约球根花卉发展的瓶颈问题。而且在繁殖过程中叶片等植株的其他部位被白白扔掉，影响环境卫生，对原有植株损伤也很大，妨碍后续生长。白花虎眼万年青(Ornithogalumthyrsoides)是百合科虎眼万年青属多年生鳞茎球根花卉，具有生命力旺盛、适应范围广、繁殖能力强、易栽培等优点，特别是表现出很强的再生能力，能够以叶片上形成多个珠芽的方式进行高效再生，即“叶上珠芽”，表现出繁殖系数高、保持生活力不退化、操作简洁高效、充分利用叶片等材料、对原有植株损伤少等显著优点，为解决鳞茎球根花卉困难提供了新的思路和途径。白花虎眼万年青叶上珠芽的机制对于科研和生产均具有较高的价值和意义，亟需深入研究；而且虎眼万年青属植物的叶片和鳞茎等器官形成的分子机制尚未见到报道。DCAF(DDB1-CUL4AssociatedFactor)是以CUL4(CULLIN4)蛋白为骨架的E3泛素－蛋白连接酶复合体，这类复合体通过一个共同的衔接蛋白DDB1(UV-DamagedDNABindingProtein1)连接不同的底物识别亚基DCAF，介导各自特定的蛋白底物的降解，从而参与调控生物体的多种生物学途径。DCAF基因是最早在人类和哺乳动物中发现的，参与了DNA的损伤修复、基因的转录、基因组的复制、组蛋白的甲基化等多种生命过程，并被认为是动物干细胞崭新的调控者，从翻译后水平调控动物干细胞的动态平衡。而在植物中研究很晚也很少，仅在拟南芥、水稻和番茄中见到报道，在拟南芥中参与了多种植物发育过程，在水稻中与败育和秕谷有关，在番茄中研究发现DCAF中的DDB1基因发生突变会产生高色素突变，DCAF基因的研究在百合科及其他植物中尚未见到报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因及应用。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因，包括a)或b)任一所述的核苷酸序列：a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；b)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。本专利技术还公开了一种上述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因编码的蛋白。进一步地，其氨基酸如SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种含上述的核苷酸序列的白花虎眼万年青QtDCAF8基因表达载体。本专利技术还公开了一种含上述的表达载体的宿主细胞。本专利技术还公开了一种QtDCAF8基因的制备方法，包括以下步骤：步骤1、提取白花虎眼万年青RNA，并反转录获得cDNA模板；步骤2、对cDNA模板进行PCR扩增，获得QtDCAF8基因编码区PCR产物；所述PCR扩增的引物包括QtDCAF8F和QtDCAF8R，其核苷酸序列分别如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；步骤3、对QtDCAF8基因编码区PCR产物进行连接反应，将其转入大肠杆菌感受态中，涂布平板，37℃倒置培养后挑取单克隆进行PCR鉴定及测序，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的QtDCAF8基因，其所编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。本专利技术还公开了一种上述的表达载体的构建方法，该方法中用到的无缝连接引物包括XbaIQtDCAF8F和KpnIQtDCAF8R；其核苷酸序列分别如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。本专利技术还公开了一种上述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因在植物珠芽和叶片再生发育机理以及培育叶形奇特的花卉植物新品种分子育种中的应用。进一步地，所述植物为鳞茎球根花卉。进一步地，所述鳞茎球根花卉为白花虎眼万年青。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：本专利技术是建立在稳定成熟的白花虎眼万年青叶上珠芽高效再生体系及其转录组分析的基础上的，克隆了E3泛素与DDB1和CUL4所组成的DDB1-CUL4ASSOCIATEDFACTOR8(DCAF8)在白花虎眼万年青中的同源基因QtDCAF8，并将其置于泛素启动子Ubiquitin下构建了组成型的植物表达载体，将其导入模式植物烟草中，发现转基因烟草的叶片和植株的生长发育产生了明显的变化，出现了叶片浅裂、叶脉紊乱等表型，是通过对干细胞的调控来实现的，是调控植物干细胞活性的重要功能基因，应用于植物珠芽和叶片等器官再生发育机理的研究，以及培育叶形奇特的花卉新品种等植物分子育种等研究中，具有很好的应用前景。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术白花虎眼万年青叶上珠芽总RNA的1％琼脂糖凝胶电泳图；其中，a和b均为总RNA的1％琼脂糖凝胶电泳条带；图2是本专利技术白花虎眼万年青QtDCAF8基因完整编码区经PCR扩增后PCR产物的1％琼脂糖凝胶电泳图；其中，1-4是扩增基因的电泳条带，5是分子量MarkerZ即DL2000plus；图3是本专利技术pUBGFP+QtDCAF8植物表达载体构建过程示意图；图4是本专利技术pUBGFP+QtDCAF8植物表达载体经双酶切检测的1％琼脂糖凝胶电泳图；图5是本专利技术转基因烟草的抗性不定芽；图6是本专利技术转基因烟草节间明显缩短的照片；图7是本专利技术转基因烟草的叶片形状发生了明显变化，其中，a代表叶片歪斜且叶脉不明显，b代表叶片极其不对称且边缘出现突起；c代表叶片主脉隆起且边缘波浪状，d代表叶片成戟形，e代表叶片部分缺失，f代表叶片主脉变粗且边缘有棱角。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1制备QtDCAF8基因：在经过灭菌的超净工作台上剪切白花虎眼万年青无菌组培苗的叶片并转接到含有细胞分裂素的培养基上，经过20～30天后，叶片表面逐渐长出多个绿色的小球，叶上珠芽开始形成，以白花虎眼万年青叶上珠芽为材料，提取RNA，并反转录成cDNA，设计相应引物进行PCR，琼脂糖凝胶电泳后，回收目的条带，与pMD19-T载体连接，转入大肠杆菌，测序并分析。挑取阳性克隆进行质粒抽提，根据pUBGFP植物表达载体的序列信息设计两条无缝融合的引物并对阳性质粒采用高保真酶进行PCR扩增，与进过线性化处理的pUBGFP植物表达载体进行无缝融合来进行植物表达载体构建，将构建好的植物表达载体用冻融法导入根瘤农杆菌LBA4404中，用叶盘法对烟草叶片进行侵染，在含有潮霉素的培养基上进行筛选，获得的抗性植株进行PCR鉴定后，观察其表型，并拍照记录。(1)总RNA提取在经过本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种白花虎眼万年青Qt DCAF8基因，其特征在于，包括a)或b)任一所述的核苷酸序列：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；b)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种白花虎眼万年青QtDCAF8基因，其特征在于，包括a)或b)任一所述的核苷酸序列：a)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列；b)SEQIDNO.1所示的核苷酸序列经替换，缺失或添加碱基形成的具有同等功能的核苷酸序列。2.一种权利要求1所述的白花虎眼万年青QtDCAF8基因编码的蛋白。3.根据权利要求2所述的蛋白，其特征在于，其氨基酸如SEQIDNO.2所示。4.一种含有权利要求1所述的核苷酸序列的白花虎眼万年青QtDCAF8基因表达载体。5.一种含有权利要求4所述的表达载体的宿主细胞。6.一种QtDCAF8基因的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、提取白花虎眼万年青RNA，并反转录获得cDNA模板；步骤2、对cDNA模板进行PCR扩增，获得QtDCAF8基因编码区PCR产物；所述PCR扩增的引物包括QtDCAF8F和QtDCAF8R，其核苷酸序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：姜福星，黄远祥，周鹏，何伟，
申请(专利权)人：四川天艺生态园林集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51