一种小报春体细胞胚诱导方法技术

本发明专利技术公开了一种小报春体细胞胚诱导方法，包括如下步骤：1)无菌播种获得小报春无菌苗；2)将步骤1)获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；3)将步骤2)诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；4)体细胞胚萌发生根。本发明专利技术首次建立了小报春的体细胞胚诱导方法，可以快速获得小报春体细胞苗，诱导效率高，成苗周期短。此外，与传统的叶片愈伤组织诱导不定芽和叶片直接诱导不定芽途径相比，能显著提高农杆菌介导的遗传转化效率，为小报春转基因育种奠定了基础。

【技术实现步骤摘要】
一种小报春体细胞胚诱导方法
本专利技术属于植物生物
，具体涉及一种小报春体细胞胚诱导方法。
技术介绍
报春花科植物共74属，其中报春花属(PrimulaLinn.)是报春科中最大的属，在世界范围内大概有500种，大多位于北半球，该属植物主要分布在两个地区，一个是喜马拉雅山脉，另一个是我国的云南、西藏及四川地区。报春花是我国著名的观赏花卉，在国内外的栽植历史已有数百年之久[张艳丽.小报春(Primulaforbesii)生物学特性初步研究[D].北京林业大学,2003.]，其开花时间早，花期长，色彩丰富，花型各具特色，具有极高的观赏价值，与杜鹃、龙胆并称为世界三大高山花卉和中国三大天然名花[胡启明.种子植物科属地理[M].北京:科学出版社,1999.]。中国幅员辽阔，拥有的报春花种类繁多，我国共约有300种[中国科学院中国植物志编委会.中国植物志(第59卷第2分册)[M].北京:科学出版社,1990]，分布较为广泛，但是这些资源多位于我国西南地区的边远山区，与外界的联系不畅通，处于野生状态，采集研究的困难较大，很多种类都还有待开发利用。加之地震、泥石流等自然因素，以及旅游开发、过度放牧及挖掘等人为因素，使得野生报春花资源遭到严重破坏，尤其是一些稀有的报春花种类，其数量大大减少，生存环境也受到一定程度的破坏，急需切实有效的保护举措。在对报春花进行园林应用的过程中，国外发现了这种植物资源的巨大潜力，对其开展了大量研究，推进了园艺化应用的进程，所培育出的园艺品种繁多，在国内外广泛种植。与国外相比，中国对报春花的园林应用研究方面远远落后，很多报春花资源长期处于野生状态，未见其相关研究与报道，因此有很多资源无法得到有效利用，也无法转化为商品。特别是引种方面，还处于初步探索的阶段，还有许多野生报春花的园林应用潜力巨大，亟待开发利用，中国丰富的报春花资源优势尚未得到发挥。为了进一步在报春花的育种工作上取得新的进展，我国丰富的种质资源应得到充分的利用，针对一些中国特有的种质资源，应该加大开发与利用力度。小报春(Primulaforbesii)又名田埂报春，属于报春花科报春花属，为我国特有种，是分布于云南及四川地区的一种二年生草本花卉，具有细弱的根状茎和多数虚根。叶片基生成莲座状，通常卵圆形，多被细柔毛；花葶1至数枚，自叶丛中抽出，花序被粉，伞形花序1-2轮或多于2轮，每轮5-15朵花，花瓣5枚，花冠淡红或淡紫，裂片先端深凹陷，直径约1cm(陈封怀和胡启明，1990)。该种是报春花属植物中为数不多的具有浓郁香气的种，具有较高的观赏价值，其生命力强，播种繁殖极易成活，在野外经常成片生长，大面积的观赏效果极佳。且这两种报春花分布于较低海拔高度的地区，引种驯化相对容易，是极具园林开发潜力的盆花和香花地被植物。因此积极开展小报春的再生体系研究，加快引种驯化进度，充分利用野生资源，使其成为具有商业价值的栽培种，对创造我国自主知识产权的新品种，具有十分重要的意义。报春花属植物主要的繁衍方式为种子繁殖，受环境条件影响较大，种子活力低，人工培育困难，加之种子细小，寿命短，要求新采收的种子及时播种，否则出苗量极低，效率低下，不利于在园林中的大范围应用。在生物技术不断发展的当下，针对植物繁殖效率低下的问题，组织培养是快速高效解决该问题的一条重要途径，在园林植物新品种选育中应用较为广泛，具有成本低，生产效率高，繁殖速度快，可生产脱毒苗等特点。金晓霞等，小报春的组织培养和植株再生，植物生理学通讯，第41卷第6期，2005年12月，公开了小报春的组织培养和植株再生，具体公开了以小报春幼嫩叶片为外植体，进行丛生芽的诱导和增殖。小报春幼嫩叶片可在不同的培养基上先诱导愈伤组织，愈伤组织再分化出不定芽，也可以不经愈伤组织过程直接从叶片上分化出不定芽。目前我国园林中应用的报春花属植物主要有藏报春(P.sinensis)、四季报春(P.obconica)、欧报春(P.vulgaris)等园艺品种，花型多样，色泽艳丽，但普遍缺少花香性状。小报春独有的浓郁花香亦使其成为改良该属植物花香性状的理想材料。报春花种类繁多，遗传背景复杂，存在自交不亲和、异型花柱、种间染色体基数变化大等特点，且具有浓郁花香的种类不多，因此以常规育种方法培育芳香型报春花往往难以实现。随着非常规育种手段的不断更新，分子育种可以通过外源基因的导入定向修饰报春花的某个或某些目标性状，进而实现报春花分子设计精确育种。今后，利用植物遗传转化技术改良报春花花香性状将成为报春花育种的重要目标。农杆菌侵染法是植物遗传转化中常见的方法。然而，在小报春遗传转化中，发现农杆菌侵染后，无论是直接出芽途径还是愈伤不定芽途径均无法有效获得转化苗。在农杆菌侵染后，抗性愈伤组织无法分化出不定芽，也无法直接实现从叶片直接出芽，因此，亟需开发一种能有效提高转化率的小报春分化方法。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术提供一种小报春体细胞胚诱导方法。1、一种小报春体细胞胚诱导方法，包括如下步骤：1)无菌播种获得小报春无菌苗；2)将步骤1)获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；3)将步骤2)诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；4)体细胞胚萌发生根。其中，所述的胚性愈伤组织诱导培养基为添加了0.1-0.5mg/L的2,4-D和0.5-1.0mg/L6-BA的MS培养基，优选地，所述胚性愈伤组织诱导培养基还添加了200-400mg/L的水解酪蛋白。在本专利技术一个实施方案中，将胚性愈伤组织接种于体细胞胚分化培养基中诱导出体细胞胚，所述的体细胞胚分化培养基为添加了0.05-0.2mg/L的2,4-D和1.0-3.0mg/L6-BA的MS培养基，优选地，所述体细胞胚分化培养基还添加了200-400mg/L的水解酪蛋白。在本专利技术另一个实施方案中，将诱导出的胚状体接种到生根培养基中进行萌发生根，其中，所述的生根培养基为添加了0.01-0.05mg/LIBA的1/2MS培养基。其中，无菌播种的具体步骤为：选择当年收获的人工培养植株的种子，黑暗储藏于4℃冰箱中；接种前用75％酒精表面灭菌30S，然后用无菌水冲洗5-6次，接着用1％的次氯酸钠溶液浸泡1min，再用无菌水冲洗5-6次，然后用无菌滤纸吸干多余水分，接种于MS培养基中。其中，叶片接种时，将叶片外沿剪去，分割成0.5-1cm2的小块，叶正面朝下接触培养基。在本专利技术另一个实施方案中，所述方法还包括将胚性愈伤组织进行增殖的步骤，增殖的培养基为添加了0.1-0.3mg/L的2,4-D、0.2-0.8mg/L6-BA、200-400mg/L的水解酪蛋白的MS培养基。本专利技术首次建立了小报春的体细胞胚诱导方法，可以快速获得小报春体细胞苗，诱导效率高，成苗周期短。此外，与传统的叶片愈伤组织不定芽和叶片直接不定芽途径相比，能显著提高农杆菌介导的遗传转化效率，为小报春转基因育种奠定了基础。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：/n1)无菌播种获得小报春无菌苗；/n2)将步骤1)获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；/n3)将步骤2)诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；/n4)体细胞胚萌发生根。/n

【技术特征摘要】
1.一种小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)无菌播种获得小报春无菌苗；
2)将步骤1)获得的无菌苗叶片接种到胚性愈伤组织诱导培养基诱导出胚性愈伤组织；
3)将步骤2)诱导的胚性愈伤组织诱导出体细胞胚；
4)体细胞胚萌发生根。


2.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，所述的胚性愈伤组织诱导培养基为添加了0.1-0.5mg/L的2,4-D和0.5-1.0mg/L6-BA的MS培养基。


3.如权利要求2所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，所述胚性愈伤组织诱导培养基还添加了200-400mg/L的水解酪蛋白。


4.如权利要求1所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，将胚性愈伤组织接种于体细胞胚分化培养基中诱导出体细胞胚，所述的体细胞胚分化培养基为添加了0.05-0.2mg/L的2,4-D和1.0-3.0mg/L6-BA的MS培养基。


5.如权利要求4所述的小报春体细胞胚诱导方法，其特征在于，所述体细胞胚分化培养基还添加了200-400...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾茵，黄远祥，李西，周鹏，江明艳，姜贝贝，
申请(专利权)人：四川天艺生态园林集团股份有限公司，四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51