一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法技术

本发明专利技术公开了一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，是将采集的窖泥样品置于选择性培养基中富集培养，可以快速简单地分离窖泥中的梭菌，进而为后续对窖泥梭菌的应用提供菌源。本发明专利技术方法可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法不仅可以快速简便地富集出厌氧梭菌，而且富集的窖泥厌氧梭菌可作为一种功能菌液应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，从而提高浓香型白酒的质量。

A method of enrichment of anaerobic Clostridium Clostridium in pit mud

The invention discloses a method for enriching the anaerobic Clostridium Clostridium of pit mud, which is to enrich the collected pit mud samples in the selective medium, and can quickly and simply separate the Clostridium in the pit mud, and then provide the bacteria source for the subsequent application of Clostridium pits. The method can quickly, economically and specifically enrich the anaerobic Clostridium from the pit mud. This method can not only quickly and easily enrich the anaerobic Clostridium, but also the enriched cellar anaerobic Clostridium can be used as a kind of functional bacteria liquid used in the cellar irrigation, pit maintenance, artificial pit mud culture, and esterification liquid production. In order to improve the quality of Luzhou flavor liquor, the quality of Luzhou flavor liquor was improved.

【技术实现步骤摘要】
一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法
本专利技术涉及一种厌氧细菌的富集方法，具体地说是一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，属于生物

技术介绍
我国酿酒历史悠久，酒文化源远流长，传统工艺精湛，产品风格独特，在世界蒸馏酒中独树一帜，其中浓香型白酒在所有香型白酒的生产及销售比例中占70％，其产量和品质明显影响着中国白酒行业的发展。浓香型白酒的生产是以窖池和酒醅为基础，环境微生物、大曲微生物和窖泥微生物复杂的物质能量代谢过程。窖泥作为浓香型白酒功能菌生长繁殖的主要载体，其微生物在发酵过程中产生的有机酸和酯类等代谢产物是浓香型白酒窖香的基础。且有研究表明，对浓香型白酒香气贡献最大的是梭状芽孢杆菌，其主要代谢产物是己酸、丁酸和氢，并指出己酸菌和甲烷菌共生时能促进己酸生成。且厌氧梭菌作为一种重要的功能菌，其培养液广泛应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等。对窖泥功能菌研究发现，其群落结构组成非常复杂，包括厌氧异养菌、甲烷菌、梭菌、乳酸菌、硫酸盐还原菌、硝酸盐还原菌等，利用传统的方法想要快速分离厌氧梭菌存在一定的难度，需要反复涂布、分离、纯化，工作量较大，不利于厌氧梭菌的分离。
技术实现思路
为了解决上述问题，本专利技术旨在提供一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，可以快速简便地富集出厌氧梭菌，进而对改善浓香型白酒的质量具有重要意义。本专利技术窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，包括如下步骤：步骤1：窖泥样品的采集从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存，并迅速带回实验室接种。步骤2：配制厌氧梭菌富集的选择性培养基选择性培养基为强化梭菌培养基，只要适合厌氧梭菌生长的培养基即可，优选配制方法如下：将蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母粉3.0g、葡萄糖5.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、乙酸钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g、刃天青(0.1％，厌氧指示剂)1.5mL混合，加超纯水定容至1L，混合均匀后调节pH值为6.7-6.9(厌氧梭菌最适生长pH值范围)，获得厌氧梭菌富集的选择性培养基。配制好后装入厌氧瓶中密闭储存，厌氧瓶的装液量在50-80％。步骤3：液体培养基除氧向装有步骤2获得的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；高压灭菌的温度为121℃，时间为20min。步骤4：窖泥的厌氧接种将步骤1采集的窖泥样品以1-5％的接种量(质量体积比1-5％，如100mL培养基接种窖泥1-5g)加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，拧紧瓶盖使其密闭后混匀。步骤5：厌氧梭菌的富集培养将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于恒温培养箱中，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3-5次。步骤6：高通量测序比较富集前后的梭菌含量通过高通量测序的方法(该方法是一种广泛应用的检测基因核酸序列的测定方法。要求提供检测样品的基因组DNA，且基因组DNA的OD值260/280须大于1.8，无蛋白质，或无肉眼可见的污染杂质，还应完整、无降解，电泳结果基因组DNA主带最大条带23Kb以上且主带清晰、无弥散。)比较富集前后样品中的梭菌比例，检验富集效果。由图1、图2对比可知，经本专利技术方法富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的。本专利技术提供的窖泥厌氧梭菌(Clostridium)的富集方法，可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法不仅可以快速简便地富集出厌氧梭菌，而且富集的窖泥厌氧梭菌可作为一种功能菌液应用于的灌窖、窖池保养、人工窖泥培养、酯化液的制作等，从而提高浓香型白酒的质量。附图说明图1是窖泥样品Genus分类水平中物种profiling柱状图(富集前)。图2是梭菌富集液Genus分类水平中物种profiling柱状图(富集后)。具体实施方式体现本专利技术特征与优点的典型实施例将在以下的说明中详细叙述。应理解的是本专利技术能够在不同的实施例上，具有各种的变化，其皆不脱离本专利技术的范围，且其中的说明及图示在本质上是当作说明用，而非用以限制本专利技术。下述实施例中，富集前及富集后对样品中的厌氧梭菌在总群落结构中的比例，可经高通量测序检测得出，当富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的，如图1和图2所示。本实施例中窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法如下：1、窖泥样品的采集采用池底五点采样法，从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存，并迅速带回实验室接种。采集时可以采用本领域技术人员所公知的窖泥采样器采集，或者其他方法，本专利技术并不限制，但是一般应该在窖池出完池子清扫后立即对池底窖泥进行采集，以免敞口太久部分厌氧菌失活。2、配制厌氧梭菌富集的选择性培养基将蛋白胨10.0g、牛肉粉10.0g、酵母粉3.0g、葡萄糖5.0g、可溶性淀粉1.0g、氯化钠5.0g、乙酸钠3.0g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂0.5g、刃天青(0.1％，厌氧指示剂)1.5mL混合，加超纯水定容至1L，混合均匀后调节pH值为6.7-6.9(厌氧梭菌最适生长pH值范围))，获得厌氧梭菌富集的选择性培养基，装入厌氧瓶中密闭储存，厌氧瓶的装液量在50-80％。3、液体培养基除氧在未灭菌之前，向装有步骤2获得的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气(纯氮为佳)，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；然后待培养基冷却至40～50℃之后，在厌氧工作站中分装至除氧后的200mL无菌厌氧瓶中备用。高压灭菌的温度为121℃，时间为20min。4、窖泥的厌氧接种将步骤1采集的窖泥样品置于于厌氧工作站中放置30～60min除氧，然后以1-5％的接种量加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，每个样品三个平行，拧紧瓶盖使其密闭后混匀。5、厌氧梭菌的富集培养将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于厌氧工作站(或三气恒温培养箱或恒温生化培养箱)中培养，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3-5次。采用此方法可以简便有效的对窖泥中的厌氧梭菌进行富集。6、高通量测序比较富集前后的梭菌含量通过高通量测序的方法比较富集前后样品中的梭菌比例，检验富集效果。由图1、图2对比可知，经本专利技术方法富集后富集液中的厌氧梭菌(Clostridium)在Genus分类水平占比由富集前窖泥样品的0.27％提高到74.16％，表明富集效果较好，达到了富集的目的。综上所述，本专利技术提供的对窖泥中厌氧梭菌(Clostridium)的富集方法，根据实验表明，本专利技术对窖泥中厌氧梭菌的富集方法，一般可在20～30天左右完成。由此可见其不仅可以快速、经济、特异的从窖泥中实现对厌氧梭菌的富集，采用此方法还可以快本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：窖泥样品的采集从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存；步骤2：配制厌氧梭菌富集的选择性培养基选择性培养基为强化梭菌培养基；步骤3：液体培养基除氧向装有步骤2配制的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；步骤4：窖泥的厌氧接种将步骤1采集的窖泥样品加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，拧紧瓶盖使其密闭后混匀；步骤5：厌氧梭菌的富集培养将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于恒温培养箱中，34℃下恒温培养7天，观察产气情况，按照相同的培养条件重复富集培养3‑5次。

【技术特征摘要】
1.一种窖泥厌氧梭菌Clostridium的富集方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1：窖泥样品的采集从窖龄≥30年且一直在连续使用的窖池中采集池底的新鲜窖泥，采集的窖泥样品装入大口径螺口瓶或自封袋中密闭保存；步骤2：配制厌氧梭菌富集的选择性培养基选择性培养基为强化梭菌培养基；步骤3：液体培养基除氧向装有步骤2配制的选择性培养基的厌氧瓶中通入氮气，至选择性培养基的颜色由蓝色变为浅粉红色或无色，再拧紧瓶口使其在密闭条件下高压灭菌；步骤4：窖泥的厌氧接种将步骤1采集的窖泥样品加入步骤3获得的除氧、灭菌后的液体培养基中，拧紧瓶盖使其密闭后混匀；步骤5：厌氧梭菌的富集培养将步骤4获得的接种窖泥后的厌氧瓶置于恒温培养箱中，34...

【专利技术属性】
技术研发人员：王艳丽，何宏魁，葛向阳，刘国英，王录，李安军，周庆伍，孟雅静，
申请(专利权)人：安徽瑞思威尔科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽,34