双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法技术

本发明专利技术公开了双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，属于生物传感技术领域。该技术利用金‑铂纳米复合材料和DNA模拟酶合成了对H2O2具有良好的双重催化作用的纳米探针，并利用石墨烯/金纳米颗粒纳米复合材料修饰电极以提高修饰电极的电子传递能力，从而实现对金黄色葡萄球菌的快速、高灵敏检测。在优化的实验条件下，该电化学免疫传感器对金黄色葡萄球菌表现出较为宽广的线性检测范围。此外，该传感器已成功用于对纯牛奶以及酸奶样品中的金黄色葡萄球菌的定量检测。相比于传统的平板菌落计数法等方法，本发明专利技术方便快速、操作简单、灵敏度高，实现了对金黄色葡萄球菌的快速、高灵敏检测。

Detection of Staphylococcus aureus in milk by double signal amplification

The invention discloses a detection method of Staphylococcus aureus in milk by double signal amplification, and belongs to the field of Biosensing Technology. This technique uses platinum nanocomposites and DNA analogue enzymes to synthesize a nano probe which has a good dual catalytic effect on H2O2, and uses graphene / gold nanoparticle nanocomposites to modify the electrode to improve the electron transfer ability of the modified electrode, thus the rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus is achieved. Under the optimized experimental conditions, the electrochemical immunosensor showed a broad linear detection range for Staphylococcus aureus. In addition, the sensor has been successfully applied to the quantitative detection of Staphylococcus aureus in pure milk and yogurt samples. Compared with the traditional method of plate colony counting, the invention is convenient, quick, easy to operate and high sensitivity, and realizes rapid and sensitive detection of Staphylococcus aureus.

【技术实现步骤摘要】
双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法
本专利技术提供了一种基于纳米材料和DNA模拟酶双重信号放大作用构建电化学免疫传感器实现牛奶中金黄色葡萄球菌的高灵敏检测，属于生物传感

技术介绍
食品安全是一个引发全球性关注的公共卫生问题，随着食品生产规模的逐渐扩大，明显的表现就是在过去一段时间内全球持续不断爆发的食品安全事件，由其所引发的各种食源性疾病就是其中之一。食源性疾病不仅给人类健康造成了严重的危害，同时也造成了大量的社会经济损失。金黄色葡萄球菌在自然界中随处可见，水、空气以及排泄物中都可找到，是最主要的食源性致病菌之一。它可引起从浅表的皮肤感染、软组织感染、肺感染、败血症等多种感染性疾病。除此之外，金黄色葡萄球菌不仅是食品感染的主要病原菌，也是医院肺炎及伤口等临床感染的主要致病菌，而抗生素的滥用导致了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的出现，并使其成为继艾滋病、乙型肝炎之后的世界第三大感染疾病。目前针对金黄色葡萄球菌的检测技术主要有平板菌落计数法、免疫学方法(如酶联免疫法)、分子生物学方法(如PCR技术)等方法。这些方法虽然能实现对金黄色葡萄球菌的检测，但是也有它们各自的缺点。如平板菌落计数法所需时间长、成本高，并不适合于大规模、实时检测样品中的金黄色葡萄球菌。酶联免疫法需要利用生物酶，生物酶的活性易受环境因素比如温度、pH等的影响。PCR技术操作复杂、成本高以及对操作人员技术要求较高等。电化学免疫传感技术是将电化学技术与免疫技术相结合，它既具有电化学技术的高灵敏、操作简单、仪器小型化、快速等优点，又具有免疫技术高特异性与强专一性等优点。纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度(1～100nm)范围或者由该尺度范围的物质为基本结构单元构成的材料的总称。纳米材料在光、电、磁、热、力学、机械等方面性能与普通材料大不相同，使得它们能在各领域中被广泛应用。其中金属纳米颗粒一直被广泛地用于电化学分析检测中。由于贵金属纳米颗粒具有良好的催化性能，因此经常被用作无机催化剂。与生物酶相比，无机纳米催化剂具有便宜、易制备、纳米结构稳定等优点。在各种无机催化剂中，铂纳米颗粒具有其独特的特点，比如高催化性、良好的水溶性、稳定性以及生物相溶性。有研究报道基于双金属的纳米催化剂其催化性能远远高于单金属纳米颗粒，因此将其用于电化学检测中能大大增加检测灵敏度。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种简便，快速，高灵敏的检测金黄色葡萄球菌的方法。本专利技术的技术方案为：双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，按照下述步骤进行：(1)金纳米颗粒(AuNPs)的制备将一定量的HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液继续煮沸4min，直至颜色变成酒红色并保持不变，放置冷却到室温，并放于冰箱中保存。其中步骤(1)中HAuCl4·6H2O溶液的摩尔浓度为0.3mM，柠檬酸钠的质量分数为1％，HAuCl4·6H2O溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为200:3。(2)石墨烯-金纳米颗粒纳米复合材料(GO-AuNPs)的制备将羧基化氧化石墨烯(GO)溶液和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗，接着加入上述AuNPs溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗并置于4℃的冰箱中保存。其中步骤(2)中GO浓度为0.5mg/mL，GO溶液与AuNPs溶液的体积比为1:2。(3)金-铂纳米复合材料(Au@PtNPs)的制备将HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液，继续煮沸几分钟，直至颜色变成酒红色并保持不变。随后将抗坏血酸溶液(过量的)加入到煮沸的AuNPs溶液中，随后加入一定量的K2PtCl6溶液。继续加热，直至颜色变为黑色并保持不变。然后将Au@PtNHs溶液离心并水洗三次，烘干成粉末备用。其中步骤(3)中HAuCl4·6H2O溶液的摩尔浓度为0.3mM，柠檬酸钠的质量分数为1％，抗坏血酸溶液的摩尔浓度为0.1M，K2PtCl6溶液的摩尔浓度为0.6mM。HAuCl4·6H2O溶液、柠檬酸钠溶液、抗坏血酸溶液和K2PtCl6溶液的体积比为200:3:4:200。(4)纳米探针的制备将Au@Pt溶液与链酶亲和素(SA)溶液在室温下反应1h，并不断搅拌。然后将溶液于8000rpm下离心10min，并用pH5.5PBS洗三次，除去未反应的SA。然后再将DNA-Hemin复合物(将DNA溶液与Hemin溶液在37℃的摇床里反应1h。)加入到上述溶液中，于室温下反应1h，并不断搅拌，然后离心并清洗。最后用pH7.4PBS溶液定容，保存在4℃冰箱中备用。其中步骤(4)中Au@Pt溶液浓度为5mg/ml，SA溶液浓度为0.2mg/ml，DNA溶液的摩尔浓度为1μM，Hemin溶液的摩尔浓度0.2mM。DNA溶液与Hemin溶液的体积比为1:2。Au@Pt溶液、SA溶液和DNA-Hemin复合物的体积比为1:1:6。(5)金黄色葡萄球菌-生物素化抗体复合物的制备将一定浓度的金黄色葡萄球菌(S.aureus)溶液与生物素化的抗金葡抗体混匀置于37℃下反应40min并不断振动，然后离心，并用PBS清洗多余的抗体。(6)工作电极的修饰将裸玻碳电极(GCE)依次用粒径为0.3、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次用体积比为1:1的HNO3水溶液、质量浓度为95％的乙醇、二次蒸馏水分别超声清洗2min，最后用氮气吹干备用。将(2)中制备的GO-AuNPs混合液滴涂于玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，并用PBS清洗三次。然后将电极浸入到0.5mg/mL链酶亲和素(SA)溶液里并于4℃下反应1h，从而将SA固定在修饰电极表面，然后再用PBS清洗三次以除去多余的SA。为了防止非特异性吸附，将1％BSA溶液滴加在上述修饰电极表面反应1h，然后用PBS清洗三次，并置于4℃冰箱中备用。其中(6)中滴涂在电极表面的GO-AuNPs混合液、SA溶液和BSA-PBS溶液均为10μL。(7)传感器的制备及金黄色葡萄球菌的检测取10μL(5)中复合溶液加入到(6)中已制备好的电极上反应0.5h并清洗，然后取10μL(4)中的纳米探针滴涂到上述电极表面，反应0.5h并清洗，然后进行电化学检测。将制得的免疫传感器作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系。将该三电极体系置于含20mMH2O2的PBS缓冲溶液里，利用时间-电流(i-t)曲线进行检测。以金黄色葡萄球菌浓度的对数为横坐标，对应的电流为纵坐标，绘制标准曲线，进而获得相应的线性回归方程。其中步骤(7)中i-t检测的条件是：初始电位：-0.4V，运行时间：300s。当金黄色葡萄球菌浓度为1.52×102～1.52×107CFU/mL时，其线性方程为：△I＝7.03933lgC-1.17631，检测限为：25CFU/mL。原理：本研究主要基于抗原-抗体之间的特异性反应、生物素与链酶亲和素之间的亲和反应以及Au@PtNPs复合材料、DNA模拟酶对过氧化氢的催化作用构建了信号放大的夹心式电化学免疫传感器。首先合成了GO-AuNPs复合材料起到增大电极的导电性以及固定生物分子的作用。另外还合成了本文档来自技高网...

【技术保护点】
双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)金纳米颗粒(AuNPs)的制备将一定量的HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液继续煮沸4min，直至颜色变成酒红色并保持不变，放置冷却到室温，并放于冰箱中保存；(2)石墨烯‑金纳米颗粒纳米复合材料(GO‑AuNPs)的制备将羧基化氧化石墨烯(GO)溶液和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗，接着加入上述AuNPs溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗并置于4℃的冰箱中保存；(3)金‑铂纳米复合材料(Au@Pt NPs)的制备将HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液，继续煮沸几分钟，直至颜色变成酒红色并保持不变；随后将抗坏血酸溶液(过量的)加入到煮沸的AuNPs溶液中，随后加入一定量的K2PtCl6溶液；继续加热，直至颜色变为黑色并保持不变；然后将Au@Pt NHs溶液离心并水洗三次，烘干成粉末备用；(4)纳米探针的制备将Au@Pt溶液与链酶亲和素(SA)溶液在室温下反应1h，并不断搅拌；然后将溶液于8000rpm下离心10min，并用PBS(pH 5.5)洗三次，除去未反应的SA；然后再将DNA‑Hemin复合物(将DNA溶液与Hemin溶液在37℃的摇床里反应1h；)加入到上述溶液中，于室温下反应1h，并不断搅拌，然后离心并清洗；最后用PBS(pH 7.4)溶液定容，保存在4℃冰箱中备用；(5)金黄色葡萄球菌‑生物素化抗体复合物的制备将一定浓度的金黄色葡萄球菌(S.aureus)溶液与生物素化的抗金葡抗体混匀置于37℃下反应40min并不断振动，然后离心，并用PBS清洗多余的抗体；(6)工作电极的修饰将裸玻碳电极(GCE)依次用粒径为0.3、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次用体积比为1:1的HNO3水溶液、质量浓度为95％的乙醇、二次蒸馏水分别超声清洗2min，最后用氮气吹干备用；将(2)中制备的GO‑AuNPs混合液滴涂于玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，并用PBS清洗三次；然后将电极浸入到0.5mg/mL链酶亲和素(SA)溶液里并于4℃下反应1h，从而将SA固定在修饰电极表面，然后再用PBS清洗三次以除去未反应SA；为了防止非特异性吸附，将1％BSA溶液滴加在上述修饰电极表面反应1h，然后用PBS清洗三次并置于4℃冰箱中备用；(7)传感器的制备及金黄色葡萄球菌的检测取10μL(5)中复合溶液加入到(6)中已制备好的电极上反应0.5h并清洗，然后取10μL(4)中的纳米探针滴涂到上述电极表面，反应0.5h并清洗，然后进行电化学检测；将制得的免疫传感器作为工作电极，铂丝电极为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，组成三电极体系；将该三电极体系置于含20mM H2O2的PBS缓冲溶液里，利用时间‑电流(i‑t)曲线进行检测；以金黄色葡萄球菌浓度的对数为横坐标，对应的电流瞬间变化值为纵坐标，绘制标准曲线，进而获得相应的线性回归方程。...

【技术特征摘要】
1.双重信号放大作用的牛奶中金黄色葡萄球菌的检测方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)金纳米颗粒(AuNPs)的制备将一定量的HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液继续煮沸4min，直至颜色变成酒红色并保持不变，放置冷却到室温，并放于冰箱中保存；(2)石墨烯-金纳米颗粒纳米复合材料(GO-AuNPs)的制备将羧基化氧化石墨烯(GO)溶液和聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗，接着加入上述AuNPs溶液混合搅拌0.5h，使其混合均匀，然后离心并清洗并置于4℃的冰箱中保存；(3)金-铂纳米复合材料(Au@PtNPs)的制备将HAuCl4·6H2O溶液加热煮沸并不断搅拌，然后加入柠檬酸钠溶液，继续煮沸几分钟，直至颜色变成酒红色并保持不变；随后将抗坏血酸溶液(过量的)加入到煮沸的AuNPs溶液中，随后加入一定量的K2PtCl6溶液；继续加热，直至颜色变为黑色并保持不变；然后将Au@PtNHs溶液离心并水洗三次，烘干成粉末备用；(4)纳米探针的制备将Au@Pt溶液与链酶亲和素(SA)溶液在室温下反应1h，并不断搅拌；然后将溶液于8000rpm下离心10min，并用PBS(pH5.5)洗三次，除去未反应的SA；然后再将DNA-Hemin复合物(将DNA溶液与Hemin溶液在37℃的摇床里反应1h；)加入到上述溶液中，于室温下反应1h，并不断搅拌，然后离心并清洗；最后用PBS(pH7.4)溶液定容，保存在4℃冰箱中备用；(5)金黄色葡萄球菌-生物素化抗体复合物的制备将一定浓度的金黄色葡萄球菌(S.aureus)溶液与生物素化的抗金葡抗体混匀置于37℃下反应40min并不断振动，然后离心，并用PBS清洗多余的抗体；(6)工作电极的修饰将裸玻碳电极(GCE)依次用粒径为0.3、0.05μm的氧化铝粉末反复打磨至镜面，再依次用体积比为1:1的HNO3水溶液、质量浓度为95％的乙醇、二次蒸馏水分别超声清洗2min，最后用氮气吹干备用；将(2)中制备的GO-AuNPs混合液滴涂于玻碳电极表面，置于红外灯下烘干，并用PBS清洗三次；然后将电极浸入到0.5mg/mL链酶亲和素(SA)溶液里并于4℃下反应1h，从而将SA固定在修饰电极表面，然后再用PBS清洗三次以除去未反应SA；为了防止非特异性吸附，将1％BSA溶液滴加在上述修饰电极表面反应1h，然后用PBS清洗三次并置于4℃冰箱中备用；(7)传感器的制备及金...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩恩，程喜红，丁文龙，蔡健荣，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32