一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M 2017409，保藏日期：2017年7月5日。该菌株产生的褐藻胶裂解酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；在优选条件下，未经分离纯化的粗酶液酶活达到68.5U/mL；本发明专利技术所述菌株HQZ08发酵培养基成分简单，发酵时间较短，可用于大量制备褐藻胶寡糖。

A strain producing alginate lyase and its application

The present invention discloses Cobetia Marina HQZ08 and its application. The strain is preserved in China's typical culture center. The address: Wuhan University, Wuhan, China, postal code: 430072, the preservation number: CCTCC No:M No:M 2017409, the date of preservation: July 5, 2017. The alginate lyase produced by the strain is an extracellular enzyme, and the isolation and purification are simple and no cell breakage is needed. Under the optimum conditions, the enzyme activity of the crude enzyme is 68.5U/mL without separation and purification, and the fermentation medium of the strain HQZ08 is simple and the fermentation time is short, which can be used in a large amount of preparation of alginate oligosaccharides.

【技术实现步骤摘要】
一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用
本专利技术属于微生物菌株及其应用
，具体涉及一株产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌及其制备褐藻胶裂解酶的发酵方法与褐藻胶寡糖的制备方法。
技术介绍
褐藻胶是一种从海洋褐藻中提取的多糖，在食品、医药、日用化工等行业都有普遍的应用，但由于其粘度高，水溶性低，不易被人体吸收，在应用方面受到一定的限制。褐藻胶寡糖是褐藻胶经降解得到的聚合度2～10的低聚糖，由于水溶性好，容易被人体吸收，因此其在医药领域具有较高的应用价值。研究表明褐藻胶寡糖具有神经保护、抗哮喘、抑菌、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖血脂、抗凝血及促生长等活性，并且能有效抵抗人体衰老，是一种极具开发潜力的低聚糖。现有技术中褐藻胶寡糖的制备方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。物理法操作简单，无污染，节约试剂，可以有效的切断大分子链，但是降解所得的极限分子质量较大，不易制备出分子量较小的寡糖。化学降解法包括酸降解法及氧化降解法，酸解法降解速度慢，需要高温高压，降解效率低，活性较高的寡糖含量不高，且会对环境造成污染。氧化降解法反应过程简单，成本较低，但降解条件剧烈且对寡糖的还原端有一定的破坏作用。而酶解法是一种条件温和可控性强和特异性高的生物降解方法，具有降解产物活性高、产物专一性好、反应条件温和、无污染等诸多优势，但由于缺乏产酶活力高的菌株，导致褐藻胶裂解酶产量低下，提高了酶解法的生产成本，限制了该法的推广应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株产褐藻胶裂解酶的菌株。本专利技术产褐藻胶裂解酶的菌株名称为：海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCCNo：M2017409，保藏日期：2017年7月5日。本专利技术的另一个目的提供一种由上述产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08发酵制备褐藻胶裂解酶的方法，具体包括如下步骤：(1)将海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH7～7.5；步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH7～7.5；步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH7～7.5。本专利技术还提供一种褐藻胶寡糖的制备方法，其步骤为：(1)将海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；(5)以步骤(4)所得褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶进行酶解，酶解体系如下：加酶量40～70U/g，底物浓度0.5～1％，酶解缓冲液为pH7～8的PBS缓冲液，酶解温度35～45℃，酶解时间36～48h；(6)将步骤(5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未降解的海藻酸钠，制得褐藻胶寡糖；步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH7～7.5；步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH7～7.5；步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH7～7.5。本专利技术的有益效果是：1、本专利技术的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08产生的褐藻胶裂解酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；2、本专利技术的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08营养要求简单，发酵时间短；3、本专利技术的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08的产酶活性比较高，在优选条件下，未经过纯化的粗酶液酶活力达到68.5U/mL；4、本专利技术的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08所产的褐藻胶裂解酶反应条件温和，对环境无污染；5、本专利技术的褐藻胶寡糖的制备方法简单，成本低，可用于褐藻胶寡糖的大量制备。附图说明图1为本专利技术实施例1所筛选出的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08在平板培养基上的菌落形态图；图2为本专利技术所述菌株与blast结果相近的菌株的16SrDNA序列构建的系统发育树；图3为培养基pH对海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；图4为培养温度对海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；图5为培养时间对海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；图6为接种量对海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；图7为本专利技术实施例5所制得的褐藻胶寡糖的TLC色谱图。具体实施方式以下通过具体实施方式结合附图对本专利技术的技术方案进行进一步的说明和描述。实施例1：产褐藻胶裂解酶菌株的筛选(1)、50mL富集培养基分装于250mL锥形瓶中，取少量海泥以无菌水振荡30min，然后将该振荡液和采集到的海水分别接种到富集培养基中，接种量均为5mL，30℃培养48h。(2)、初筛培养基倒平板，将富集培养的海水和海泥菌液分别进行10-1～10-7梯度稀释，对10-3～10-7稀释度的菌液进行涂布，30℃培养48h。观察菌落周围透明圈大小，选取生长状况良好且透明圈较大的菌株为出发菌株，进行平板划线分离纯化。(3)、将50mL液体种子培养基装入250mL的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产褐藻胶裂解酶的菌株，所述菌株名称：海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M 2017409，保藏日期：2017年7月5日。

【技术特征摘要】
1.一株产褐藻胶裂解酶的菌株，所述菌株名称：海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCCNo：M2017409，保藏日期：2017年7月5日。2.一种根据权利要求1所述产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08发酵制备褐藻胶裂解酶的方法，具体包括如下步骤：(1)将海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH7～7.5；步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH7～7.5；步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH7～7.5。3.一种根...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶静，张娜，肖美添，黄雅燕，
申请(专利权)人：华侨大学，
类型：发明
国别省市：福建,35