一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌制造技术

本发明专利技术公开了一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌。该伴生细菌为荧光假单胞菌（

A genetically modified bacterium associated with banana perforated nematode

The invention discloses an associated bacterium of banana perforating nematode with genetic transformation potential. The associated bacterium is Pseudomonas fluorescens (Pseudomonas fluorescens).

【技术实现步骤摘要】
一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌
本专利技术涉及生物
，更具体地，涉及一种具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌。
技术介绍
植物线虫病是由植物寄生线虫侵袭和寄生引起的植物病害。受害植物可因侵入线虫吸收体内营养而影响正常的生长发育；线虫代谢过程中的分泌物还会刺激寄主植物的细胞和组织，导致植株畸形，以及利用天敌控制等。使农产品减产和质量下降。其中吗，香蕉穿孔线虫(Radopholussimilis)又名香蕉烂根病，是香蕉、花卉种植业及很多经济作物的最危险的专性寄生线虫，寄主范围非常广泛，已报道的寄主植物有350多种。该线虫除严重危害香蕉、胡椒和椰子外，还危害大豆、玉米、高梁、甘蔗、茄子、咖啡、番茄和马铃薯等经济作物及红掌、竹芋、棕榈等观赏植物。由于该线虫危害严重，因此，有55个国家对其实施官方控制，中国也将该线虫列为禁止入境的一类植物检疫危险性有害生物。目前防治该线虫主要还是以化学杀线剂为主，而化学药剂的大量使用对环境、人畜、植物和其它有益生物造成极大的危害和其它负面影响，在许多国家和地区已被严格限制使用。生物防治手段具有环保、安全和可持续性等特点，研究和利用有效的生物防治方法防治香蕉穿孔线虫已倍受关注。在自然界中，无论是腐生线虫、动物寄生线虫和植物寄生线虫与细菌之间都存在着多种互作关系，其中包括捕食、寄生、共栖和共生等。如异小杆线虫属(Heterorhabditis)和斯氏线虫属(Steinernema)分别与发光杆菌属(Photorhabdus)和嗜线虫致病属(Xenorhabdus)细菌形成互惠共生关系，这种关系主要体现在细菌信息、营养、抗菌和致病作用，以及线虫对细菌的保护和媒介作用等。而植物病原线虫与细菌的共生关系并不像动物寄生线虫与细菌的关系那样密切，如大豆胞囊线虫的胞囊表面和内部存在大量的细菌，数量可达到2.6×105cfu/胞囊，其中主要包括Lysobacterspp.、Varovoraxspp.、Rhizobiumsp.、Xanthomonassp.、Pedobacterheparinus、Pseudomonasfluorescens等。然而这些细菌并不是大豆胞囊线虫严格专性的共生菌，但对大豆胞囊线虫的胞囊在土壤中长期存在具有重要的生态作用。2009年Haegeman等在香蕉穿孔线虫体内发现了Wolbachia家族成员，这是首次报道在植物寄生线虫中发现Wolbachia，而在其它植物寄生线虫中尚均未发现Wolbachia，这类细菌主要通过胞质不亲和、孤雌生殖、杀雄性、雌性化和增强雄性或雌性生殖力等多种方式调控其宿主的生殖活动。在自然条件下，植物寄生线虫与所处环境的大量微生物接触，并发生相互作用关系，最后形成一个微生态群落，揭示其中的微生物多样性将有利于我们了解它们之间的互作关系。在植物寄生线虫伴生细菌的研究工作中，松材线虫与其伴生细菌的关系的研究最为广泛而深入。有研究表明，松材线虫体表的浸泡物对其伴生细菌的生长繁殖具有促进作用，反过来细菌的分泌物或细菌本身对线虫也具有趋向作用和促进繁殖的作用，但这种互利关系并不是特异的，分离自不同的松材线虫种群的细菌对所有松材线虫都有促进作用，反过来，松材线虫体表也可以附生多种细菌。不同地区的松材线虫种群所携带的细菌种类和组成也不尽不相同，如中国的松材线虫伴生细菌主要以假单胞菌(Pseudomonassp.)为主；美国松材线虫种群以成团泛菌(Pantoeaagglomerans)为主；日本松材线虫种群主要以芽孢杆菌(Bacillusspp.)为主。香蕉穿孔线虫寄生植物根部，在根内和根际土壤中均能完成生活史，据报道香蕉穿孔线虫与根际和土壤中的一些细菌有着伴生关系(Zhengetal.2012)。这些伴生细菌在寄主线虫的作用机制研究和防治方面有着重要的作用和意义。目前为止，并没有关于香蕉线虫伴生菌及其生防作用的研究报道。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选出一株优势伴生细菌，为杀线虫蛋白酶基因的介导表达提供了一种遗传改良目标菌，由于该目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，被改良表达杀线虫蛋白酶基因后，可用于香蕉穿孔线虫的的生物防治。本专利技术的第一个目的是提供一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)pf36。本专利技术的第二个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在防治香蕉穿孔线虫中的应用。本专利技术的第三个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共生的功能菌方面的应用。本专利技术的第四个目的是提供所述荧光假单胞菌pf36在构建香蕉穿孔线虫生防工程菌方面的应用。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下技术方案予以实现的：一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)pf36，已于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心；保藏编号为GDMCCNo：60278；保藏地址：中国广东省微生物研究所。该菌株是从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选出得一株可与香蕉穿孔线虫稳定伴生的优势细菌，因此其在防治香蕉穿孔线虫中的应用，应在本专利技术的保护范围之内。同时，所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共生的功能菌方面的应用，应在本专利技术的保护范围之内。具体地，是将功能基因转化至所述荧光假单胞菌pf36构建功能工程菌。由于该工程菌能够与香蕉穿孔线虫稳定伴生，因此可以以该菌为介导，实现对香蕉穿孔线虫的操作。如：所述荧光假单胞菌pf36在构建香蕉穿孔线虫生防工程菌方面的应用。具体是将具有杀香蕉穿孔线虫活性的生物酶的编码基因转化至所述荧光假单胞菌pf36构建杀线工程菌。该工程菌能够与香蕉穿孔线虫稳定伴生，因此工程菌所表达的杀线生物酶可以实现杀线作用。与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术从香蕉穿孔线虫多个种群中分离筛选了一株优势伴生细菌，为杀线虫蛋白酶基因的介导表达提供了一种遗传改良目标菌，由于该目标菌与香蕉穿孔线虫的伴生关系，被改良表达杀线虫蛋白酶基因后，可用于香蕉穿孔线虫的生物防治，也为植物线虫的防治提供了一种新的思路和方法。本专利技术在筛选上述具有遗传改造潜力的香蕉穿孔线虫伴生细菌时，继代培养了10个香蕉穿孔线虫种群，且各线虫种群均在胡萝卜愈伤组织上继代培养3次以上，可确保分离的细菌与香蕉穿孔线虫具有稳定的伴生关系。同时综合了生物安全性和遗传改造背景等因素，确定分离频率较高的荧光假单胞菌pf36菌株具有遗传改造潜力的伴生细菌，其不仅遗传改造潜力强，而且经过案例验证了，将具有杀香蕉穿孔线虫活性的生物酶的编码基因(如蛋白酶pase4基因)与其进行转化构建的工程菌与香蕉穿孔线虫伴生关系稳定，杀线作用显著，且对作为安全性高，具有很好的应用前景。附图说明图1为香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌菌株在NA平板上的培养特征(37℃，48h)。图2为香蕉穿孔线虫伴生细菌和胡萝卜愈伤组织内生细菌菌株菌株的显微特征。图3为香蕉穿孔线虫伴生细菌菌株的基因组DNA提取电泳结果；M：DNAmarker；1～48：依次为xjy1～xjy5、yj1～yj6、kqj1～kqj4、zbj1～zbj6、hz1～hz6、xinj1～xin本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌（

【技术特征摘要】
1.一种香蕉穿孔线虫伴生细菌荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）pf36，其特征在于，于2017年11月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo：60278。2.权利要求1所述荧光假单胞菌pf36在防治香蕉穿孔线虫中的应用。3.权利要求1所述荧光假单胞菌pf36在构建能够与香蕉穿孔线虫共...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢辉，王东伟，陈德强，丁善文，其他发明人请求不公开姓名，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东,44