葡萄糖氧化酶基因Glox、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用制造技术

本发明专利技术属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因Glox及巴斯德毕赤酵母的制备、构建和应用。是以5￠端ATGAAGCTCCTTGGCCTCC和3￠端CTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC为特异引物，以扩展青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得葡萄糖氧化酶基因Glox，并成功构建了巴斯德毕赤酵母工程菌。本发明专利技术解决了目前重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达的问题，利用本发明专利技术获得了全长的Glox基因及其构建的穿梭表达载体，进一步转化到毕赤酵母X33菌株，经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株。本发明专利技术方法简单易行，成本低廉，这为葡萄糖氧化酶大规模生产奠定了良好的基础。

Glucose oxidase gene Glox, protein, Pichia pastoris Pasteur and its preparation and Application

The invention belongs to the preparation of the new gene and the construction of the engineering bacteria, especially the preparation, construction and application of a glucose oxidase gene Glox and Pichia Pasteur. The glucose oxidase gene Glox was obtained by extending Penicillium DNA as a template with the 5 primers of ATGAAGCTCCTTGGCCTCC and 3 CTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC as the specific primers, and the engineered strain of Pichia pastoris was successfully constructed by PCR amplification. The present invention solves the problem of heterologous expression of the recombinant glucose oxidase gene, and uses the invention to obtain the full length Glox gene and its constructed shuttle expression vector. It is further transformed into the X33 strain of Pichia pastoris, and a strain with higher secretion of glucose oxidase from the original strain is screened and identified. The method is simple and cheap, which lays a good foundation for large-scale production of glucose oxidase.

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖氧化酶基因Glox、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用
本专利技术属于新基因的制备及工程菌的构建，特别是指一种葡萄糖氧化酶基因Glox、蛋白、巴斯德毕赤酵母及其制备和应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能够专一的催化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶的催化特性使其具有去葡萄糖、脱氧、杀菌等功能,且安全无毒无副作用,是国家允许使用的酶制剂之一，在食品的加工保鲜、医学等方面都有广泛的应用。葡萄糖氧化酶广泛分布于动植物、微生物体内。由于霉菌产酶能力强，目前用于研究和工业化菌种主要有黑曲霉和青霉属菌株，但霉菌发酵生产葡萄糖氧化酶过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当的困难。扩展青霉属于青霉的一种，同样存在这样的问题。近几年市场对葡萄糖氧化酶的需求量逐年增长，对质量要求也逐年提高。所以我国葡萄糖氧化酶技术水平所存在的产量低、酶活低、提纯繁琐、酶活检测方法操作复杂等问题亟待解决。重组葡萄糖氧化酶基因进行异源表达可有效地解决这些问题。尤其是毕赤酵母表达外源蛋白具有表达量高、稳定性好、培养成本低和产物易分离纯化等优点，适于大体积高密度连续发酵，具有强且易控的醇氧化酶(Alcoholoxidase，AOX)启动子等优点，可严格控制外源基因的表达。通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，获得萄糖氧化酶准确高效的生产和提取方法，提高产酶量，为后期的工业化生产提供了导向基础，提高其经济效益。申请人在申请号为201510893562.8的专利技术专利申请中公开了一种葡萄糖氧化酶基因GOD、利用其编码的蛋白以及转化的毕赤酵母基因工程菌。葡萄糖氧化酶基因GOD是以5′端ATGAAGTCCACTATTATCACCTCCA和3′端CTAGGCACTTTTGGCATAGTCTTCA为特异引物，以点青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。获得了全长的GOD基因及其构建的穿梭表达载体，进一步转化到毕赤酵母基因工程菌，经筛选鉴定得到一株较原始菌株较高分泌表达葡萄糖氧化酶的菌株，所获得的转基因毕赤酵母工程菌，在10L发酵罐水平检测条件下，甲醇诱导144小时，发酵液中的酶活达到594U/ml，显著提高了发酵酶活；并且通过基因工程手段改造葡萄糖氧化酶生产菌株，还可以获得萄糖氧化酶准确高效的生产，提高产酶量(9g/L)。上述现有技术存在的问题是GOD的大规模生产广泛采用黑曲霉或青霉菌发酵，但黑曲霉和青霉菌发酵生产GOD过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂蛋白的存在给纯化带来相当大的困难。因此，通过构建工程菌实现葡萄糖氧化酶的异源高效表达，研制及生产高品质的GOD制剂，是一条比较经济有效的途径。申请人检索的对比文件包括：1、申请号为CN105936910A的专利文献中出发菌株为黑曲霉的GOD做的异源表达，但其酶活表达水平仅为77U/ml。另外其做了突变，氨基酸序列有改变，我们仅对基因序列做了改变，但氨基酸序列与原始出发菌株扩展青霉的一致。其毕赤酵母为重组毕赤酵母GS115，我们用的是X33。2、申请号为CN106591249A的专利文献中所用的菌株为黑曲霉，对黑曲霉的发酵工艺做了优化，但霉菌发酵生产葡萄糖氧化酶过程中，过氧化氢酶、纤维素酶及淀粉酶等大量杂酶的存在给纯化带来相当的困难。3、申请号为CN105950577A的专利文献中对CN105936910A的提升，对上面序列做了突变，使得酶热稳定性有所提高。并未提及发酵酶活。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种葡萄糖氧化酶基因Glox。本专利技术的目的之二在于提供一种葡萄糖氧化酶基因Glox的制备方法。本专利技术的目的之三在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因Glox编码的蛋白。本专利技术的目的之四在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因Glox转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris。本专利技术的目的之五在于提供一种利用葡萄糖氧化酶基因Glox转化毕赤酵母基因工程菌的方法。本专利技术的整体技术构思是：葡萄糖氧化酶基因Glox，其基因序列为SEQIDNo.1。葡萄糖氧化酶基因Glox的制备方法，是以5′端ATGAAGCTCCTTGGCCTCC和3′端CTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC为特异引物，以扩展青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。利用萄萄糖氧化酶基因Glox编码的蛋白，其序列为SEQIDNo.2。利用葡萄糖氧化酶基因Glox转化的毕赤酵母基因工程菌，其保藏编号为CGMCCNo.13358。本专利技术中的毕赤酵母基因工程菌申请人已于2016年11月30日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCCNo.13358，该保藏机构的地址位于北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，该保藏机构的简称为CGMCC。利用葡萄糖氧化酶基因Glox转化的毕赤酵母基因工程菌的制备方法，其制备方法中的步骤如下：a、通过PCR方法设计引物将将扩展青霉的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去除，引物序列如下：Glox-F:5′GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCCTTCCACAAGCTGACTTCGACC3′；序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；Glox-R:5′GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC3′；序列中下划线部分为下游添加限制性内切酶NotI识别位点；b、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和NotI位点上，转化到E.coliDH5α，酶切验证筛选阳性克隆，并送测序；c、测序正确重组质粒pMD-AOX-Glox经PmeI酶切后线性化，用2μg线性化pMD-AOX-Glox质粒电击转化80μl毕赤酵母PichiapastorisX33感受态细胞，然后将转化细胞涂于含100μg/mlG418的YPDS平板上，30℃培养96h；获得巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo.13358。巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo.13358在制备葡萄糖氧化酶中的应用。本专利技术的具体技术构思还有：巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo.13358在制备葡萄糖氧化酶中的应用，包括如下工艺步骤：A、将巴斯德毕赤酵母PichiapastorisCGMCCNo.13358接种于无菌的YPD培养基培养12-16h；B、按体积比为3％接种量将步骤A培养后的菌种转接于体积为100ml的无菌BMGY培养基，在温度为30℃的条件下摇瓶培养至OD600≈6-7；C、按照10％的体积比将步骤B中的培养后的菌种接种于盛有无菌BSM的培养基的发酵罐中，在温度为30℃、转速550转/分钟、pH＝5的条件下培养至菌体OD600≈90；D、流加50％甘油，每升甘油中含12mLPTM1,流加速度为12mL/h/L,温度为30℃的条件下培养4h，OD600≈150-170，停止补料0.5-1h，确认甘油耗尽；E、按照流加速度为3.0mL-5.0mL/h/L流加入诱导剂甲醇，每升甲醇中含12mLPTM1，pH用氨水维持在6.0-6.5，每隔12小时取样测定酶活，当本文档来自技高网...

【技术保护点】
葡萄糖氧化酶基因Glox，其特征在于其基因序列为SEQ ID No.1。

【技术特征摘要】
1.葡萄糖氧化酶基因Glox，其特征在于其基因序列为SEQIDNo.1。2.葡萄糖氧化酶基因Glox的制备方法，其特征在于是以5′端ATGAAGCTCCTTGGCCTCC和3′端CTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC为特异引物，以扩展青霉DNA为模板，采用PCR扩增方法获得。3.利用葡萄糖氧化酶基因Glox编码的蛋白，其特征在于其序列为SEQIDNo.2。4.利用葡萄糖氧化酶基因Glox转化的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris，其特征在于其保藏编号为CGMCCNo.13358。5.根据权利要求4所述的巴斯德毕赤酵母Pichiapastoris的制备方法，其特征在于采用如下方法制备：a、通过PCR方法设计引物将扩展青霉PenicilliumexpansumCICC40658的葡萄糖氧化酶基因序列中的信号肽编码序列去除，引物序列如下：Glox-F:5′GGCTGAAGCTTACGTAGAATTCCTTCCACAAGCTGACTTCGACC3′，序列中下划线部分为上游引物添加限制性内切酶EcoRI识别位点；Glox-R:5′GAGATGAGTTTTTGTTCTAGAGCGGCCGCCTAATTAACAGTAGCGTTGTAATC3′，序列中下划线部分为下游添加限制性内切酶NotI识别位点；b、PCR产物经纯化回收采GIBSON连接到表达载体pMD-AOX的EcoRI和NotI位点上，转化到E.coliDH5α，酶切验证筛选阳性克隆，并...

【专利技术属性】
技术研发人员：高庆华，胡美荣，董聪，王玥，王庆庆，陶勇，罗同阳，王云鹏，马清河，
申请(专利权)人：河北省微生物研究所，中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：河北,13