一种葡萄籽原花青素的提取方法技术

本发明专利技术涉及一种葡萄籽原花青素的提取方法。本发明专利技术克服了葡萄籽种皮中原花青素难以溶出及其提取物中原花青素聚合度高的难题，采用黑曲霉为菌种发酵葡萄籽，利用黑曲霉产生的纤维素酶、果胶酶等酶类降解葡萄籽种皮利于原花青素的溶出，采用不同体积分数的乙醇作为解吸液洗脱大孔吸附树脂，将原花青素分级，然后进行部分酸解，以利于增加提取物中原花青素低聚体的含量。本发明专利技术所得的提取物中低聚原花青素含量≥98％，其平均聚合度在2.5～3.0之间，在体内易吸收，抗氧化活性强。

A method for extraction of Proanthocyanidins from grape seed

The invention relates to a method for extracting grape seed procyanidins. The invention overcomes the difficult problem that the proanthocyanidins are difficult to dissolve and the polyanthocyanidins have high degree of polymerization in the extract of the grape seed seed, and the grape seed is fermented by Aspergillus niger as a strain, and the cellulase and pectinase enzymes produced by Aspergillus Niger are used to degrade the grape seed seed, and the ethanol is used in different volume fraction of ethanol. As a solution adsorption elution macroporous adsorption resin, the proanthocyanidins were graded and then partially hydrolyzed, in order to increase the content of proanthocyanidin oligomer in the extract. The content of oligomeric proanthocyanidins in the extract obtained is more than 98%, and its average polymerization degree is between 2.5 and 3, which is easy to absorb and has strong antioxidant activity in vivo.

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄籽原花青素的提取方法
本专利技术属于天然产物活性物质提取领域，具体涉及一种葡萄籽原花青素的提取方法。
技术介绍
原花青素(proanthocyanidins)又称为缩合单宁(condensedtannins)，是黄烷-3醇单体通过C4-C8或C4-C6位连接成一定聚合度的分子，存在形式为游离、寡聚和多聚物，其基本单元主要是儿茶素、表儿茶素、没食子酸及表儿茶素没食子酸酯等。按聚合度大小可分为低聚原花青素(简称OPC，基本单元的二、三、四聚体)和高聚原花青素(简称PPC，基本单元的聚合度大于4)。其中低聚原花青素可被人体吸收利用，且具有比其组成单元更高的抗氧化活性；高聚原花青素难以透过生物膜，不能被人体吸收利用，因此降低葡萄籽提取物中原花青素的聚合度可增加提取物的吸收利用率。原花青素广泛分布于葡萄籽、松树皮等高等植物组织中。在植物体中原花青素具有抗生物或非生物胁迫的功能，如抗紫外线、抗病以及调节种子休眠和萌发等。一系列研究表明原花青素是一种强的抗氧化剂，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍。从食品中摄取原花青素可以延缓衰老，预防动脉粥样硬化和心血管疾病如心脏病、心血管病、高血压，而且对糖尿病、帕金森病、肥胖症和癌症等有一定的药理功效。现已广泛应用于食品、化妆品和保健品等领域。葡萄籽提取物作为一种天然存在的强效抗氧化剂，具有显著清除人体自由基的功能，其应用已经有40多年的历史，到上个世纪90年代欧美等发达国家对葡萄籽提取物的应用与开发成为热点。在此潮流的影响下，国内相关的研究也逐渐展开，近年来国内以葡萄籽提取物为原料的保健食品越来越多。由于葡萄籽提取物中功效成分含量太复杂，而且各葡萄籽提取物原料生产厂家和应用厂家对葡萄籽提取物中功效成分的认识不统一。但目前国内厂家对自己葡萄籽提取物的标注多为原花青素含量≥95％，未提到原花青素聚合度及单体的含量，经测定其产品原青花素的平均聚合度较大，一般都在8.0以上。中国专利CN105130941A公开了一种葡萄籽提取物的制备方法，采用粉碎后的葡萄籽添加水和酵母后密封发酵，然后再用丙烷和二甲醚萃取葡萄籽油，用无水乙醇作为萃取剂进行亚临界萃取，获得原花青素提取物。中国专利CN101100464A中公开了高氧化自由基吸收能力(ORAC)的低聚原花青素及其提纯方法，所述的低聚原花青素产品含有质量百分数为45～65％的低聚原花青素，其制备方法为采用超滤膜截留相对分子量在5～100万之间的分子，制得高ORAC值的低聚原花青素。中国专利CN103910706B公开了一种低成本的低聚原花青素的制备方法，其采用冷溶、过滤、纳滤、喷雾干燥等技术，在其制备过程中采用质量浓度为4～6％的亚硫酸氢钠溶液，进行高聚原花青素的降解，取得了一定的效果。中国专利CN200510013084.3通过用截留相对分子量为5000和1000的低蛋白吸附的改性聚醚砜平板超滤膜，提纯葡萄籽提取物中的低聚原花青素，其中5000膜超滤原花青素得率为25.18％，单体儿茶素得率为74.11％；1000膜超滤原花青素得率为34.76％，单体儿茶素得率为48.58％。中国专利CN104529990A公开了一种从葡萄籽中提取原花青素的方法，其采用纤维素酶进行葡萄籽中纤维素的降解以利于种皮中原花青素溶出，得到纯度95％以上的寡聚原花青素。在上述文献中所涉及的原花青素的提取方法中，采用酶进行纤维素的降解以利于原花青素的溶出，其成本投入较高，而且在酶解过程中需要适宜酶解的温和条件，操作较为复杂。采用超滤膜过滤提取特定分子段的原花青素过程中，目前仍还存在膜通量小、所需膜面积大、处理量少、超滤时间长、难以实现规模化工业生产等缺陷。
技术实现思路
为克服葡萄籽种皮中原花青素难以溶出及其提取物中原花青素聚合度高的问题，本专利技术提供了一种利于葡萄籽种皮中原花青素溶出及降低其提取物中原花青素聚合度的制备方法。本专利技术技术方案如下：一种葡萄籽原花青素的提取方法，以葡萄籽为原料，经清洗、碾压粉碎，发酵处理，逆流提取、大孔树脂吸附、分级解吸附、酸解、降温过滤，喷雾干燥制得。具体地，上述葡萄籽原花青素的提取方法，包括以下步骤：1)葡萄籽的预处理，选取无霉变的葡萄籽(鲜品)，放入清洗池中，用无菌水清洗，沥干或采用干燥的葡萄籽为原料，将干燥的葡萄籽在无菌水中浸泡，使其充分吸水，浸泡清洗后沥干。将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过碾压间隙。2)葡萄籽进行发酵处理，以黑曲霉为菌种，经过活化、一级扩培、二级扩培制得发酵菌种。将预处理后的葡萄籽与菌种按一定比例进行接种，混合后在一定条件下进行固体发酵。3)原花青素粗品的制备，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，提取后合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗品。4)原花青素分级：将原花青素粗品配成一定浓度的水溶液进行大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1。5)原花青素的制备，取原花青素水溶液组分2加入混合酸，在一定条件下进行酸解，获得酸解液。调整酸解液pH，并于原花青素水溶液组分1进行混合，降温，低温滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物。所述葡萄籽碾压为将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过0.5～1.0mm的碾压间隙。经过碾压机处理后葡萄籽成扁平形状，成粒性好，种皮被碾出几道裂缝，清晰可见胚乳渗出。经过碾压后的葡萄籽在黑曲霉发酵过程中，渗出的胚乳可提供充足的营养利于黑曲霉的生长。且碾压后的葡萄籽成粒性较好，有利于黑曲霉生长过程中的氧气供应，有利于生长过程中酶的产生。所述葡萄籽发酵所采用的菌种为黑曲霉(Aspergillusniger)，可采用市售高产纤维素酶和果胶酶的黑曲霉菌株。发酵条件为温度24～28℃，湿度80～90％，发酵时间36～60h，期间每隔8h进行翻拌一次。黑曲霉在生长的过程中，其在菌丝顶端不断分泌相应的酶类，如纤维素酶、果胶酶、蛋白酶、脂肪酶等，其中纤维素酶和果胶酶可降解葡萄籽种皮中的纤维素和果胶，从而利于种皮中包裹的原花青素在提取中释放出来。蛋白酶和脂肪酶可分解胚乳中的蛋白质和脂肪，其分解产物既有利于自身的生长，同时还可降低提取过程中葡萄籽油的含量。在研究中发现，合适的温度、湿度及环境中存在的营养物质，对酶及酶的产量有关。研究发现黑曲霉发酵能使葡萄籽中可提取的总酚含量增加，其产生的酶系可降解葡萄籽种皮中的结合态多酚，控制好发酵时间，即可使提取物中的低聚原花青素含量增高。所述三级四罐式逆流提取方式，提取溶剂为pH为4.5～5.5(乙酸调pH)的体积分数为80～85％乙醇溶液；和/或提取温度为70～75℃；和/或每罐的提取时间为10～20min。按照上述方式循环进行提取，合并上述存储的提取液，离心或过滤除去絮状沉淀，获得无沉淀液提取液。将无沉淀提取液进行减压蒸馏(蒸馏条件为:60～80℃，真空度为0.06～0.08MPa)，回收乙醇，获得原花青素水溶液，将原花青素水溶液进行喷雾干燥，获得原花青素粗提取物。研究发现，采用相对低pH的提取溶剂可增本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄籽原花青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)葡萄籽的预处理：选取无霉变的葡萄籽，洗净，晾干，碾压；2)葡萄籽进行发酵处理：将预处理后的葡萄籽接种黑曲霉菌，进行固体发酵；3)原花青素粗品的制备：以乙醇为提取溶剂，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，喷雾干燥，获得原花青素粗品；4)原花青素分级：将原花青素粗品配成一定浓度的水溶液进行大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2；所述低浓度解吸液为体积分数为25～30％的乙醇；所述高浓度解吸液为体积分数为60～65％的乙醇；5)原花青素的制备：向原花青素水溶液组分2中加入混合酸，进行酸解，获得酸解液；调整该酸解液pH，将其与所述原花青素水溶液组分1混合，滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物；所述混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄籽原花青素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：1)葡萄籽的预处理：选取无霉变的葡萄籽，洗净，晾干，碾压；2)葡萄籽进行发酵处理：将预处理后的葡萄籽接种黑曲霉菌，进行固体发酵；3)原花青素粗品的制备：以乙醇为提取溶剂，将发酵后的葡萄籽采用三级四罐式逆流提取方式进行提取，合并提取液进行减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液，喷雾干燥，获得原花青素粗品；4)原花青素分级：将原花青素粗品配成一定浓度的水溶液进行大孔树脂吸附，先用低浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分1；再采用高浓度解吸液洗脱，收集洗脱液，减压蒸馏，回收乙醇，获得原花青素水溶液组分2；所述低浓度解吸液为体积分数为25～30％的乙醇；所述高浓度解吸液为体积分数为60～65％的乙醇；5)原花青素的制备：向原花青素水溶液组分2中加入混合酸，进行酸解，获得酸解液；调整该酸解液pH，将其与所述原花青素水溶液组分1混合，滤去不溶物，喷雾干燥；获得原花青素提取物；所述混合酸由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～1):(1～2)组成。2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤4)中采用AB-8型大孔树脂；优选地，所述低浓度解吸液的洗脱量为3～5倍的柱体积；和/或，所述高浓度解吸液的洗脱量为2～4倍的柱体积。3.根据权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于，步骤5)所述酸解包括向原花青素水溶液组分2中加入体积分数为5～15％的所述混合酸，在70～75℃条件下保温60～120min，获得酸解液；优选地，所述混合酸是由6％亚硫酸溶液和99.5％冰乙酸按体积比(0.5～0.8):(1～1.5)组成。4.根据权利要求1-3任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤3)中所述提取溶剂为pH为4.5～5.5的80～85％乙醇溶液；和/或所述提取温度为70～75℃；和/或每罐的提取时间为10～20min。5.根据权利要求1-4任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤1)中葡萄籽碾压为将沥干后的葡萄籽放入滚筒式碾压机中，使葡萄籽碾压通过0.5～1.0mm的碾压间隙。6.根据权利要求1-5任一项所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中发酵条件为温度...

【专利技术属性】
技术研发人员：石清东，王正元，陈赫岩，王姣，
申请(专利权)人：北京颐方生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11