葡萄糖氧化酶突变体制造技术

本发明专利技术的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列；(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；所述取代为取代1个或2个氨基酸。本发明专利技术提供的葡萄糖氧化酶单点突变体的耐热性普遍高于野生型，而且两点突变体，与对应单点突变体相比，其耐热性又得到进一步提升，在60℃处理10min后残余酶活达到71.19％～82.92％，在65℃处理5min后残余酶活达到63.03％～72.58％，70℃处理2.5min后残余酶活达到49.91％～58.96％，75℃处理2.5min后残余酶活达到24.78％～32.05％。

Glucose oxidase mutant

The aim of the present invention is to provide a glucose oxidase mutant, which has: (I) a sequence of at least 70% homology with the amino acid sequence of the glucose oxidase SEQ ID NO:1; (II) having at least one immune epitope of the glucose oxidase described in the (I) and the amino acid sequence of the glucose oxidase. An amino acid sequence obtained by modification, substitution, deletion or addition of one or more amino acids; the substitution is substituted for 1 or 2 amino acids. The heat resistance of the glucose oxidase single point mutant was generally higher than that in the wild type, and the heat resistance of the mutant was further enhanced. The residual enzyme activity reached 71.19% ~ 82.92% after 10min treatment at 60 degrees C, and the residual enzyme activity reached 63.03% ~ 72.5 at 65 Centigrade treatment for 5min. After 8%, 70 2.5min treatment, the residual enzyme activity reached 49.91% ~ 58.96%. After 75 2.5min treatment, the residual enzyme activity reached 24.78% ~ 32.05%.

【技术实现步骤摘要】
葡萄糖氧化酶突变体
本专利技术属于基因改造
，具体涉及一种葡萄糖氧化酶突变体及其应用。
技术介绍
葡萄糖氧化酶是一种需氧脱氢酶，能专一地氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸和过氧化氢。葡萄糖氧化酶通常与过氧化氢酶组成一个氧化还原系统，在分子氧存在下氧化β-D-葡萄糖生成D-葡萄糖酸内酯，同时消耗氧生成过氧化氢。过氧化氢酶将过氧化氢分解生成水和1/2氧，而后水又与葡萄糖酸内酯结合产生葡萄糖酸。葡萄糖氧化酶对β-D-吡喃葡萄糖表现出强烈的特异性，葡萄糖分子C1上的羟基对酶的催化活性至关重要，且羟基处于β位时要比在α位时高160倍。葡萄糖氧化酶对L-葡萄糖和2-O-甲基-D-葡萄糖完全没有活性。由于葡萄糖氧化酶的除氧和抗氧化作用，使其在食品、医药、饲料等方面应用非常广泛。在食品工业中，葡萄糖氧化酶作为一种食品保鲜剂，在防止啤酒老化、保持产品原有风味、延长保质期方面有显著效果，还可作为面粉改良剂和面包品质改良剂提高食品质量。在医药领域，我国医院普遍采用葡萄糖氧化酶电极法、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶偶联法等检测血液、血清中葡萄糖含量。作为一种新型的饲料添加剂，葡萄糖氧化酶能够改善动物肠道环境，调节饲粮消化，促进动物生长。葡萄糖氧化酶广泛分布于动物、植物及微生物体内，工业上主要利用黑曲霉菌或青霉菌进行生产，但是常出现酶活力不高、稳定性差、杂蛋白污染以及分离纯化繁琐等问题。因为目前在颗粒生产过程中有一个短暂的80～90℃的高温阶段。而黑曲霉来源的葡萄糖氧化酶热稳定性较差，其水溶液在65℃下保温5分钟剩余酶活性低于40％，使该酶在颗粒饲料的应用受到限制。目前采用饲料制粒后将葡萄糖氧化酶液体喷涂到饲料上的方法不仅增加设备投入，而且无法保证酶制剂的稳定性以及酶制剂在饲料中的分布均一性。因此，提高葡萄糖氧化酶热稳定性对目前饲料用葡萄糖氧化酶具有重要的现实意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种葡萄糖氧化酶突变体，其耐热性得到显著提高，有利于其在饲料领域的广泛应用。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％同源性的序列；(Ⅱ)具有所述(Ⅰ)中所述的葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；在本专利技术的另一些实施例中，所述取代为取代1个或2个氨基酸。在本专利技术的一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶具有75％以上同源性的酶；在本专利技术的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶具有80％以上同源性的酶；在本专利技术的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶具有85％以上同源性的酶；在本专利技术的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶具有90％以上同源性的酶；在本专利技术的另一些实施例中，所述的葡萄糖氧化酶突变体为与序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶具有95％以上同源性的酶；在本专利技术的一些实施例中，所述修饰包括酰胺化、磷酸化、甲基化、乙酰化、泛素化、糖基化或羰基化。在本专利技术的一些实施例中，所述葡萄糖氧化酶具有如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列，编码所述葡萄糖氧化酶的核苷酸序列之一如SEQIDNO:2所示。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶的第64位氨基酸发生了取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由A变为R，或由A变为L，或由A变为K，或由A变为M，或由A变为F，或由A变为N，或由A变为Q。编码上述第64位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQIDNO：3或SEQIDNO：5或SEQIDNO：6或SEQIDNO：7或SEQIDNO：8或SEQIDNO：9或SEQIDNO：10所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶的第415位氨基酸发生了取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第415位氨基酸由A变为K，或由A变为R，或由A变为N。编码上述第415位氨基酸发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQIDNO：4或SEQIDNO：11或SEQIDNO：12所示的核苷酸序列。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括氨基酸序列为SEQIDNO:1的葡萄糖氧化酶的第64位和第415位氨基酸同时发生了取代。在本专利技术的另一些实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由A变为R,第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为K，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为K，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为K，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为M，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为M，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为M，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为F，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为F，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为F，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为N，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为N，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为N，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为Q，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为Q，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为Q，第415位氨基酸由A变为N。在本专利技术的进一步优选实施例中，所述取代包括第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为R。编码上述第64位和第415位氨基酸同时发生了取代的葡萄糖氧化酶突变体的DNA分子，其具有如SEQIDNO：13或SEQIDNO：14或SEQIDNO：15或SEQIDNO：16所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了上述葡萄糖氧化酶突变体在饲料中的应用。本专利技术还提供了具有上述DNA分子的重组表达载体。本专利技术还提供了一种宿主细胞，包含上述重组表达载体。在本专利技术的一些实施例中，宿主细胞为毕赤酵母。本专利技术提供的葡萄糖氧化酶单点突变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任一个：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQ ID NO:1具有至少70％同源性的序列；(Ⅱ)具有(Ⅰ)中所述葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)由如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；所述取代为取代1个或2个氨基酸。

【技术特征摘要】
1.一种葡萄糖氧化酶突变体，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)或(Ⅲ)所示的氨基酸序列中任一个：(Ⅰ)与葡萄糖氧化酶的氨基酸序列SEQIDNO:1具有至少70％同源性的序列；(Ⅱ)具有(Ⅰ)中所述葡萄糖氧化酶的至少一个免疫表位，且所述葡萄糖氧化酶的氨基酸序列经修饰、取代、缺失或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列；(Ⅲ)由如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列或因遗传密码的简并性而与如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列或其互补序列的核苷酸序列不同的序列编码的氨基酸序列；所述取代为取代1个或2个氨基酸。2.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代是第64位的氨基酸被取代。3.如权利要求2所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代包括第64位氨基酸由A变为R，或由A变为L，或由A变为K，或由A变为M，或由A变为F，或由A变为N，或由A变为Q。4.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代是第415位氨基酸发生了取代。5.如权利要求4所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代包括第415位氨基酸由A变为K，或由A变为R，或由A变为N。6.如权利要求1所述的葡萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代是第64位和第415位的氨基酸被取代。7.如权利要求6所述的萄糖氧化酶突变体，其特征在于，所述的取代包括第64位氨基酸由A变为R,第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为R，第415位氨基酸由A变为N；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为K；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸由A变为R；或是第64位氨基酸由A变为L，第415位氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴秀秀，邵弨，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37