Gal4温敏型突变体、重组表达载体、温度调控系统及其应用技术方案

本发明专利技术提供Gal4温敏型突变体，及利用其该突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统及其应用。利用Gal4温敏型突变体构建的温度调控操作简单，无需添加诱导剂/抑制剂，实现对代谢流的精细调控。有利于其它对细胞毒性大的物质的生产。

Gal4 thermosensitive mutant, recombinant expression vector, temperature regulation system and its application

The invention provides a Gal4 thermosensitive mutant, and uses the mutant to construct a temperature control system in Saccharomyces cerevisiae and its application. The temperature regulation of Gal4 thermosensitive mutants is simple, and no need to add inducers / inhibitors to achieve fine regulation of metabolic flux. It is conducive to the production of other substances that are highly toxic to the cell.

【技术实现步骤摘要】
Gal4温敏型突变体、重组表达载体、温度调控系统及其应用
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及一种定向进化改造酵母转录激活蛋白Gal4，以及利用改造后的Gal4突变蛋白构建温度调控的表达系统及其应用。
技术介绍
随着代谢工程和合成生物学的发展，通过在酿酒酵母中表达异源基因来生产一些化学品变得越来越热门。但途径中的蛋白酶过表达以及外源代谢途径的中间产物积累，常常对宿主细胞造成毒害作用从而影响细胞生长。因此开发精确调控外源基因的表达至关重要。目前半乳糖调节网络是酿酒酵母中被用于基因表达的一个常用有效的系统，在这个系统中Gal4能识别GAL基因启动子的上游激活序列(UASg),激活上述基因的转录。另外这个系统中GAL4的转录受到外界碳源的紧密调节，酵母细胞在没有半乳糖的培养环境中生长时，Gal80可以和Gal4特异性结合，阻止Gal4蛋白与GAL基因启动子区的结合，从而抑制GAL基因的表达。但是由于该诱导剂在发酵过程中会被消耗，需要不时补加，且价格比较昂贵，因此这种策略在大规模发酵中并不经济。有研究通过敲除GAL80，使GAL4的转录仅受到高葡萄糖抑制，低葡萄糖诱导。并成功地利用该系统在酿酒酵母中构建了可控的类异戊二烯高效合成途径。但是，利用葡萄糖进行长途径的表达调控在实际操作中并不严谨，常常会出现泄漏表达。而且在高密度发酵中工艺复杂，基因表达很难实现人为的控制。因此通过蛋白工程手段对Gal4进行进一步的改造，使它变成一种不借助于诱导剂/抑制剂，而是通过感知温度培养因子的变化来实现对代谢途径更加精细的调控，最终使菌体的生长与产物的积累相协调具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是通过定向进化的方法来获得温敏型的Gal4蛋白突变体，以实现在酿酒酵母中构建温度调控系统为目的并将其应用到代谢产品的生产中。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了Gal4温敏型突变体，所述突变体的核苷酸序列选自以下序列：序列表中SEQIDNO:6的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:7的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:8的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:9的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:10的氨基酸序列。其中序列表中SEQIDNO:6的氨基酸序列命名Gal4M9，相对于野生型其第69位亮氨酸变成了脯氨酸，第356位丙氨酸变成了苏氨酸；序列表中SEQIDNO:7的氨基酸序列命名Gal4M61，相对于野生型其第385位缬氨酸变成了天冬氨酸；序列表中SEQIDNO:8的氨基酸序列命名Gal4M63，相对于野生型其第63位精氨酸变成了甘氨酸，第194位天冬酰胺变成了天冬氨酸；序列表中SEQIDNO:9的氨基酸序列命名Gal4M153，相对于野生型其第196位苯丙氨酸变成了亮氨酸，第297位谷氨酸变成了甘氨酸，第361为亮氨酸变成了丝氨酸；序列表中SEQIDNO:10的氨基酸序列命名Gal4M414，相对于野生型其第208位丝氨酸变成了脯氨酸。进一步，编码Gal4温敏型突变体的核苷酸序列选自下列序列：SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。任何对上述所示氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸并与上述几个序列在氨基酸水平具有至少70％同源性的序列，且具有温度敏感效果的Gal4，即在30℃活性，低温25℃或者以下活性高的突变体蛋白仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术中使用的野生型的GAL4基因来源于酿酒酵母BY4741(ATCC201388)(GenBank：NM_001184062.1)及氨基酸序列的NCBI号为DAA11189.1。采用以番茄红素为颜色指示的高通量筛选方法，实现Gal4定向进化从而获得温敏型突变株。本专利技术还提供上述Gal4温敏型突变体的获得方法，具体包括：首先通过易错PCR技术建立GAL4基因突变体库；然后利用番茄红素的颜色变化作为指示对GAL4突变库进行筛选：定向进化的具体方法：将番茄红素合成途径中的基因置于GAL1-10启动子下，使番茄红素的合成量与Gal4转录激活因子密切相关，在敲除酿酒酵母本身GAL4基因后，将无法激活GAL启动子下基因的转录，此时无相关番茄红素合成，当外源表达Gal4时，番茄红素开始合成；挑出30℃活性降低或者完全尚失，21℃恢复或部分恢复功能的温敏型Gal4蛋白。本专利技术还提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含编码上述的氨基酸序列。本专利技术一个实施例中包含温敏型Gal4M9蛋白的表达载体通过如下方法构建得到：用ACT1启动子SEQIDNO:11序列替换酿酒酵母整合型载体PUMRI-15中，得到含有ACT1启动子的酿酒酵母整合型表达质粒PUMRI-PACT1,再将本专利技术中的SEQIDNO:3序列插入整合型表达质粒PUMRI-PACT1中，得到PUMRI-PACT1-GAL4M9。本专利技术还提供基因工程菌，所述基因工程菌由上述重组表达载体转化至宿主微生物中获得。具体的，本专利技术的基因工程局为酿酒酵母工程菌。本专利技术还提供利用上述的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统的方法，首先敲除酿酒酵母染色体上GAL80基因，使GAL系统不再受半乳糖控制，进一步用HIS3标签敲除GAL4；然后将表达载体PUMRI-PACT1-GAL4M9整合到酵母染色体中，构建温度敏感的GAL系统。本专利技术还提供上述构建的Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统。进一步，本专利技术还给出了Gal4温敏型突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统在类胡萝卜素合成中的应用。将类胡萝卜素合成途径中的基因置于GAL1-GAL10启动子中，构建产类胡萝卜素的酿酒酵母工程菌株，实现产类胡萝卜素的工程菌株的生长阶段和产物合成阶段的分阶段调控。进一步，所述类胡萝卜素为虾青素或番茄红素。酵母生长达到稳定期前，将其置于30℃下培养，在这个阶段，酵母细胞的生物量增加，而类胡萝卜素合成的相关基因受到抑制不表达；当达到稳定期后，将酵母置于24℃继续培养，相关基因开始表达。为了尽可能地提高虾青素的产量，本项目温度变化的最佳时间点为对数生长中后期。本专利技术专利的有益效果包括：(1)利用番茄红素作为指示剂实现一种简单有效的高通量筛选方法，获得Gal4温敏型突变体，及利用其该突变体在酿酒酵母中构建温度调控系统及其应用。利用Gal4温敏型突变体构建的温度调控操作简单，无需添加诱导剂/抑制剂，实现对代谢流的精细调控。有利于其它对细胞毒性大的物质的生产。(2)针对细胞生长和产物积累之间的矛盾，解决长合成途径代谢调控的问题，使细胞生长和产物积累相协调，为其它长代谢途径的调控提供了理论及方法借鉴。(3)该调控对温度响应敏感，当温度转到低温，外源基因迅速表达。有利于在高密度发酵中的操作。附图说明图1为用于GAL4定向进化的策略图；图2为pUMRI-PACT1-GALM9质粒图谱；图3为温敏型的番茄红素菌株的产量图；图4为温度调控系统敏感性的荧光验证图，其中A为30℃培养72h，B为21℃培养72h；图5为温度调控系统控制类胡萝卜素生产的代谢调控示意图。本文档来自技高网...

【技术保护点】
Gal4温敏型突变体，其特征在于：所述突变体的核苷酸序列选自以下序列：序列表中SEQ ID NO:6的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO:7的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO:8的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO:9的氨基酸序列；序列表中SEQ ID NO:10的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.Gal4温敏型突变体，其特征在于：所述突变体的核苷酸序列选自以下序列：序列表中SEQIDNO:6的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:7的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:8的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:9的氨基酸序列；序列表中SEQIDNO:10的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的Gal4温敏型突变体，其特征在于，编码Gal4温敏型突变体的核苷酸序列选自下列序列：SEQIDNO:1所示的核苷酸序列；SEQIDNO:2所示的核苷酸序列；SEQIDNO:3所示的核苷酸序列；SEQIDNO:4所示的核苷酸序列；SEQIDNO:5所示的核苷酸序列；SEQIDNO:6所示的核苷酸序列。3.如权利要求1所述的Gal4温敏型突变体的获得方法，其特征在于，首先通过易错PCR技术建立Gal4温敏型突变体库；然后利用番茄红素的颜色变化作为指示对Gal4突变库进行筛选：将番茄红素合成途径中的基因置于GAL1-10启动子下，使番茄红素的合成量与Gal4转录激活因子密切相关，在敲除酿酒酵母本身GAL4基因后，将无法激活GAL启动子下基因的转录，此时无相关番茄红素合成，当外源表达Gal4时，番茄红素开始合成；挑出30℃活性降低或者完全尚失，21℃恢复或部分恢复功能的温敏型Ga...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，周萍萍，叶丽丹，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33