北方根结线虫抗性鉴定方法技术

本发明专利技术涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体的说就是北方根结线虫抗性鉴定方法，属农业植保领域。本发明专利技术包括以下步骤：(1)无菌花生毛状根制备、(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备、(3)北方根结线虫的接种于培养、(4)抗性鉴定。本发明专利技术的优点是：该鉴定方法科学，省时省力，过程简单易于操作，根据有根结根数占整个根系的百分率进行抗性评价最为简单有效。

Identification of resistance to root knot nematode in the north of China

The invention relates to a method for identifying crop pest and disease resistance, in particular, a method for identifying root knot nematode resistance in the north, belonging to the field of agricultural plant protection. The present invention includes the following steps: (1) preparation of hairy root of sterile peanut, (2) preparation of aseptic cyst nematode suspension, (3) inoculation in northern root knot nematode, and (4) resistance identification. The advantages of the invention are as follows: the identification method is scientific, time saving and labor-saving, simple and easy to operate, and the resistance evaluation is the most simple and effective according to the percentage of root knot root in the percentage of the whole root system.

【技术实现步骤摘要】
北方根结线虫抗性鉴定方法
本专利技术涉及一种农作物病虫害抗性鉴定方法，具体的说就是北方根结线虫抗性鉴定方法，属农业植保领域。
技术介绍
花生根结线虫病是花生生产上毁灭性病害之一，在我国大部分花生主产区均有发生，从发现至今一直是制约花生产量持续增加的重要限制因素。花生根结线虫病又称花生根瘤线虫病。俗称地黄病、地落病、黄秧病等是一种世界性病害，几乎所有种植花生的国家和地区都有发生。我国最早发现于山东省，目前在山东、安徽、江苏、河北、北京、辽宁、吉林、河南、湖南、湖北、广东、广西、贵州、陕西、甘肃、海南等省(市、区)均有发生，其中以山东发病最为普遍。花生感病后根的吸收功能被破坏，植株矮小发黄，结果少而稀。一般减产20％～30％，严重的可减产70％以上，甚至绝收。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何克服现有技术的不足，提供北方根结线虫抗性鉴定方法。本专利技术为实现上述目的采用的技术方案是：包括以下步骤：(1)无菌花生毛状根制备选用粒大饱满的20个花生品种种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；(3)北方根结线虫的接种于培养将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；(4)抗性鉴定调查记录根结数量，计算供试群体根内根内有根结根数占整个根系的百分率。进一步的，本专利技术北方根结线虫抗性鉴定方法，根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性，抗性分级标准:免疫：无根结；高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；高感：有根结根数占整个根系的50％以上。进一步的，本专利技术北方根结线虫抗性鉴定方法，具体试验过程如下：(1)无菌花生毛状根制备选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min；在无菌条件下，用75％酒精浸泡花生种子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒；其次用无菌水洗涤花育45种子3～4次，每次3-5min；最后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去花生种子的种皮，接种于无激素的MSB5培养基上；在无菌条件下，接种环挑取于农杆菌A4菌株，在LB+50mg/LKan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，待长出单菌落后挑取1个单菌落转入10mlLB液体培养基中；其中，LB液体培养基中添加50mg/LKan，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h；然后取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期；最后使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养。(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备收集上述花生根结样品，将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物；将混合物加入到1.0％NaClO溶液中，没过根系，混合3min；将含有NaClO溶液的混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目；薄雾喷洒40目筛上的混合物，喷洒0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，至组合筛的底部；取出组合筛中的325目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度；取出组合筛中的500目筛，用无菌水喷淋冲洗，收集冲洗液体，获得根结线虫卵悬液，离心，去除上清液，再加入200@10-6链霉素，继续离心，去除上清液，以上过程重复3次；倒去上清液,加入无菌水离心5min,以上过程重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部无菌线虫悬浮液。(3)北方根结线虫的接种于培养将上述根结线虫悬液1ml或卵悬液1ml，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；(4)抗性鉴定将步骤(3)的花生毛状根漂洗干净，调查记录根结数量，计算供试群体根内有根结根数占整个根系的百分率。本专利技术的优点是：该鉴定方法科学，省时省力，过程简单易于操作，根据虫卵以及根线虫数量指数进行抗性评价最为有效。具体实施方式下面对本专利技术提供的具体实施方式作详细说明。实施例1试验过程1.无菌花生毛状根制备选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min。(1)无菌条件下，用75％酒精浸0.5-1min,在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒，最后用无菌水洗涤3～4次，每次3-5min；处理后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去种皮，接种于无激素的MSB5培养基上。无菌条件下，用接种环挑取于-20℃低温冰箱中冻存的将发根农杆菌A4菌株，在LB+50mg/LKan的固体平板上化线接种后置于28℃恒温培养箱中暗培养，长出单菌落后挑取1个单菌落转入10mlLB液体培养基(添加50mg/LKan)中，于28℃、180r/min的摇床内暗培养复苏21h,取0.05ml该菌液于上述液体培养基再次活化(条件同上)，使其达到对数生长期。使农杆菌的A600nm＝0.6～0.8时采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养。2.无菌胞囊线虫悬浮液的制备采用机械捣碎—过筛喷淋法。用清水洗净花生根结样品，用剪刀将发病重、根结多的根系剪成长约1cm的小段，放入组织捣碎均浆机中，加适量水捣碎5～10min，形成线虫与根组织碎片的混合物。将混合物倒入装有1.0％NaClO溶液的三角瓶中，使溶液没过根系，摇晃三角瓶3min。再将混合物倒入组合筛上，组合筛自上而下依次为40目、200目、325目和500目。用喷壶形成薄雾喷洒40目筛上的混合物约0.5h，使线虫和卵从根组织内移到表面，被喷雾水冲洗至组合筛的底部。注意调节好水的流量，以免水溢出使线虫流失，喷淋后期使用无菌水。喷淋过后，取出组合筛中的325目筛，用无菌水自筛的一侧向另一侧喷淋冲洗，使线虫集中到筛的一侧，然后再用少量无菌水从筛的背面冲洗筛上物，收集液体到容器中，获得根结线虫悬液，并配成200条/ml的浓度。用同法冲洗500目筛，可制备卵悬液。将分离的线虫悬浮液分装于离心管中在离心机中离心5min(1500r/min)；倒去上清液；再加入200@10-6链霉素，离心10min(1500r/min)；如此重复3次,倒去上清液，加入无菌水离心5min(1500r/min)，重复3次；最后一次倒去上清液，留下底部约0.5mL无菌线虫悬浮液。3、北方根结线虫的接种于培养无菌条件下，将制备好的根结线虫悬液1ml(约100条)或卵悬液1ml(约100个)，均匀接至花生毛状根培养皿，盒盖静置1h，用膜封口。倒置25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫。4.抗性鉴定清水将根系漂洗干净，然后调查记录根结数量，计算供试群体根内根内有根结根数占整个根系的百分率，根据计算结果和抗性评价标准本文档来自技高网...

【技术保护点】
北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)无菌花生毛状根制备选用粒大饱满的20个花生品种的种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；(3)北方根结线虫的接种于培养将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿上，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；(4)抗性鉴定调查记录有根结根数占整个根系的百分率。

【技术特征摘要】
1.北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)无菌花生毛状根制备选用粒大饱满的20个花生品种的种子，清洗干净，表面消毒，接种于无激素的MSB5培养基上，采用发根农杆菌A4侵染无菌培养6d的花生子叶诱导毛状根，扩繁继代培养；(2)无菌胞囊线虫悬浮液的制备清洗上述发病根系，捣碎，过筛，滤液喷洒于40目、200目、325目和500目组合筛上，收集325目和500目上的线虫和卵，获得根结线虫悬液和根结线虫卵悬液；(3)北方根结线虫的接种于培养将根结线虫悬液或根结线虫卵悬液，均匀接至不同花生品种的毛状根培养皿上，盒盖静置1h，用膜封口，倒置于25℃培养42d获得大量虫卵和二龄幼虫；(4)抗性鉴定调查记录有根结根数占整个根系的百分率。2.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：根据计算结果和抗性评价标准，分别评价花生品种对北方根结线虫的抗性，抗性分级标准:免疫：无根结；高抗：有根结根数占整个根系的10％以下；抗病：有根结根数占整个根系的10％～30％；感病：有根结根数占整个根系的30％～50％；高感：有根结根数占整个根系的50％以上。3.根据权利要求1所述的北方根结线虫抗性鉴定方法，其特征在于：具体试验过程如下：(1)无菌花生毛状根制备选取粒大饱满的20个花生品种的种子用自来水冲洗20-30min；在无菌条件下，用75％酒精浸泡花育45种子0.5-1min；然后再在0.1％升汞中浸泡15min，进行表面消毒；其次用无菌水洗涤花育45种子3～4次，每次3-5min；最后，用无菌刀在无菌滤纸上剥去花生种子的种皮，接种于无激素的MSB5培养基上；在无菌条件下，接种环挑取于农杆菌A4菌株，在LB+50mg/LKan的固体平板...

【专利技术属性】
技术研发人员：任艳，袁美，尹亮，石延茂，李双铃，崔潇，李磊，江晨，
申请(专利权)人：山东省花生研究所，
类型：发明
国别省市：山东,37