线虫贮存和运输的改进方法技术

本发明专利技术阐述了线虫贮存和运输的改进方法．一方面，本发明专利技术提供了一种贮存昆虫病原线虫的方法．感染的昆虫病原线虫幼虫的乳油与吸附剂混合，并在该微生物生长受到抑制的条件下贮存．另一方面，本发明专利技术提供了另一种贮存昆虫病原线虫的方法．感染的昆虫病原线虫幼虫贮存在基本上厌氧的条件下．（*该技术在2005年保护过期，可自由使用*）

Improved method for storage and transportation of nematodes

The invention describes the nematode storage and transport method. On the one hand, the invention provides a method for storage of entomopathogenic nematodes. Mixed emulsifiable concentrate and adsorbent of entomopathogenic nematode larvae infection, and the microbial growth inhibition of storage conditions. On the other hand, the invention provides another storage of entomopathogenic nematodes. Infection of entomopathogenic nematode larvae storage basically anaerobic conditions.

【技术实现步骤摘要】
一方面，本专利技术阐述了特别适用于防治有害昆虫的昆虫病原线虫的贮存方法。另一方面，本专利技术阐述了适合于贮存和运输线虫的容器。在探索能防治有害昆虫并对环境影响最小的替代农用杀虫剂的过程中，现在的注意力正在转向生物制剂，昆虫病原线虫类，其中包括斯太内尔线虫科(Steinernematidae)和异小杆科(Hetror-habditidae)，提供了这样一种可能性。它们是昆虫的天然病原菌。在土壤中发现的昆虫病原线虫为第三期感染幼虫。它能找到并穿透昆虫的幼虫和成虫。这些线虫带有特有的共长细菌嗜线虫异小杆科/发光异小杆科(Xenorhabdus nematophilus/lumines-cens)。它们有助于杀死昆虫。在昆虫内，一旦线虫干扰昆虫的免疫系统并释放出迅速增殖的共长细菌，就会破坏昆虫的血腔(昆虫的血液和组织)。线虫开始以细菌和部分消化的血腔为食，并成熟和繁殖。该线虫和细菌一起可引起昆虫在24-72小时内死亡。用昆虫病原线虫治害虫的概念是建立在线虫的大量培养，并能有效地用于对线虫敏感的有害昆虫的基础上的。由于线虫的大量培养存在问题，以及不能有效地贮存昆虫病原线虫，用于生物防治的昆虫病原线虫的开发进程受到阻碍。过去，线虫的培养限于体内法，如在大蜡螟(Galleria mellonella)上。但最近用体外培养已取得很大进展。因为已实现人工大量培养线虫，用昆虫病原线虫作为商业生物杀虫剂的可能性更加现实了。把线虫作为化学杀虫剂的实际替代物之前，它的贮存和运输已成为关键性因素。众所周知，第三期线虫在极苛刻条件(如干燥和冷冻)下，能在土壤中很好存活相当长时间。并且当条件变得有利时，还能复苏，并在昆虫出现时感染它们。然而另一方面，线虫对于迅速干燥和处于紫外线照射和高温下易于损伤。第三期感染线虫幼虫(非喂养期)靠体内贮存的物质生存。很可能，在所希望的感染期之前的生长期间，一定种的线虫存活能力与它积累特定的能量储备(如糖原或脂类)的能力有关，也与使它们以一定速率活动的能力有关。该速率是以满足线虫幼虫不生长(存活)的需要。在感染的第三期，在环境中无助于使目标昆虫宿主感染的过快活动会继续浪费能耗，减短存活期和随后的感染机会。因此，存活时间部分地可由可利用的能量贮备决定，但也可能还包括几个另外的因素，如酶的失活作用和有毒新陈代谢付产物的产生和分泌。目前出售并用于某些昆虫的效能试验的线虫，贮存在低温(1-10℃)下。在这样的条件下，降低了线虫中的分解代谢速率。不是用连续的或间歇的方法，就是通过有限数量的线虫给密闭的容器供氧。许多工作者都强调，贮存线虫时，氧化作用的重要性和大的表面积/体积比对氧交换的重要性。(Datky et al，1964 and Hara et al，1981)。由于使用滤纸、试纸、棉绒和海绵等，提高了线虫悬浮液与空气的接触面积。例如，在100克清洁干燥的海绵上，5亿个毛纹斯太内尔线虫(Steinernema feltiae)和毛蚊斯太内尔线虫(S·bibionis)可在1-2℃，连续充气的气囊中贮存长达4个月(Bedding，1984)。上述工作者在为实验室和田间试验提供线虫的文章讨论了线虫的保存。通常由于下列缺点，所描述的、用于田间试验和实验室的线虫贮存方法都不适合于广泛的商业模规配给。例如(ⅰ)需要冷冻(ⅱ)需要氧(它通过充气或扩大充气的空间提供)(ⅲ)即便用上面提到的措施，线虫密度仍有限(最高达150000个/毫升)。(ⅳ)即便使用载菌体，仍难以抽提线虫。本专利技术的目的之一是要提供更适合于商业应用的线虫贮存和运输方法。本专利技术一个方面的内容是以感染的线虫在缺氧和低于40℃的条件下，仍能生存很长时间这一惊人发现为基础的。根据本专利技术这一方面的内容，提供了贮存昆虫病原线虫的方法，其中感染的昆虫病原线虫幼虫的乳油在基本上厌氧的条件下贮存。“基本上厌氧的条件”这一术语意思是，在这些条件下，线虫得不到游离氧。应该指出，在贮存气氛中，存在的氧的数量可能变化。厌氧作用可能意味着对于不同种的线虫有不同的O2含量。本专利技术这一方面的内容是以本专利技术者的发现为前题。即感染的幼虫在贮存期间不需要氧化作用和换气或高的表面/体积比。因此，最初的贮存条件可能是相当好氧的。但是一旦O2含量被线虫吸呼作用消耗，它就会变成厌氧条件。厌氧条件可用各种方法达到。例如，像上面提出的那样，线虫本身可消耗贮存气氛中的氧。另一方面，线虫可在真空、氮气、二氧化碳或其它惰性气体条件下装封。氧气含量最好小于0.4%(体)，特别是小于0.25%(体)。但是正如上面提出的那样，对于不同种线虫，厌氧生活可能高于上述氧浓度。上述条件与商业上使用的线虫数量有关，即每克乳油至少含0.2×106个线虫。按照以前描述的技术(线虫浓度相当低)来看，这一浓度是很惊人的。线虫最好在该微生物生长受抑制条件下贮存，特别是在抗菌剂存在的条件下。这里使用的抗菌剂这一术语指的是可破坏细菌和真菌生长或可抑制细菌和真菌生长的物质。它包括制菌剂、杀菌剂、制真菌剂和杀真菌剂。抗菌剂最好是甲醛或次氯酸钠水溶液，浓度最好为0.1-1.0%(重)。有许多替代的抗菌剂可以使用，只要它们在使用的数量范围内对线虫是无毒的。按照本专利技术另一方案，线虫贮存在容器中之前，先用能使线虫表面灭菌的抗菌剂洗涤。在本专利技术可供选择的另一方面内容中，提供了这样一种有特征的方法。在该方法中，线虫在对线虫无毒的有高渗透力的溶液中贮存和运输。在这一方案的最优形式中，线虫悬浮在浓度为30-70%(重)的单糖或二糖溶液中。例如，蔗糖或葡萄糖。因为这一原理没有限制，可以认为，高渗透力的溶液降低了线虫不希望有的生长速度。本专利技术的另一方面的内容中，线虫在吸附剂(如活性炭)或合成树脂(如Amberlite)存在下贮存。吸附剂最好呈粉状、放入凝胶中的粉或片剂。在本专利技术这一情况中，线虫乳油或悬浮液与适量吸附剂(如活性炭)混合，并在能抑制线虫生长的条件下贮存。在这一情况下，线虫可在基本上厌氧条件或好氧条件或真空下贮存。线虫最好在基本上处于厌氧条件的容器中贮存。虽然厌氧条件有助于降低线虫不希望的生长的可能性，但是人们发现，氧的存在没有多大的影响。在线虫-吸附剂混合物中，吸附剂最好为10-70%(重)。由此得出，线虫乳油最好为混合物的90-30%(重)。在线虫乳油中，线虫的浓度最好为(0.2-2)×106个线虫/克乳油。吸附剂是能把各种化学物质吸附到它的表面上的物质。这样就可以把吸附剂或其它相对惰性的物质(如木屑、海绵、砂、滤纸和非活性炭)区分开。上述这些方法阐述了线虫贮存和运输的新方法，然而本专利技术另一方面的内容，不仅根据本专利技术而且也根据已知的贮存线虫的方法，阐述了贮存和运输线虫的容器。过去，运输在载菌体基质上(如聚氨基甲酸乙酯海绵屑、滤纸、试纸、玻璃毛或木屑等)的线虫是常事，以便提高总的表面积/体积比，改进装在密封容器或开孔容器的线虫周围的空气的转移。根据本专利技术这一方面的内容，线虫贮存在粉状吸附剂或颗粒吸附剂上。在活性炭粉的情况下，线虫可与活性炭混合，但在其它许多情况下，即吸附剂呈颗粒状或运输在载菌体基质上的线虫的情况下，在线虫用于所希望的地方之前，从载菌体基质中回收线虫是必要的。回收线虫可能本文档来自技高网...

【技术保护点】
贮存昆虫病原线虫的一种方法。其中感染的昆虫病原线虫的幼虫乳油与吸附剂混合，并在该微生物生长受到抑制的条件下贮存。

【技术特征摘要】
1.贮存昆虫病原线虫的一种方法。其中感染的昆虫病原线虫的幼虫乳油与吸附剂混合，并在该微生物生长受到抑制的条件下贮存。2.如权利1要求的方法，其中上述吸附剂选自活性炭和合成树脂。3.如权利1或2要求的方法，其中活性炭的浓度为10-70%(重)。线虫乳油浓度为30-90%(重)。4.权利1～3中任何一项要求的方法，其线虫的浓度为(0.2-2)×106个线虫/克线虫乳油。5.权利1-4中任何一个要求的方法，其中线虫是斯太内尔线虫科和异小杆科纯的线虫或任何菌种的混合物。6.权利5中要求的方法，其中所说的菌种是毛蚊斯太内尔线虫、格氏斯太内尔线虫、毛纹斯太内尔线虫、嗜杆菌异小杆科和夜蛾异小杆科。7.权利1-6中任何一项要求的方法，其中微生物的生长由于抗菌剂的存在而受到抑制。8.权利1-7中任何一项要求的方法，其中在贮存前用抗菌剂洗涤线虫，抑制微生物的生长。9.权利7或8要求的方法，其中所说的抗菌剂选自甲醛和次氯酸钠。10.权利7或8要求的方法，其中所说的抗菌剂是高渗透力溶液。11.权利9要求的方法，其中所说的抗菌剂是浓度为0.1-1.0%(重)的甲醛溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：塔科尤卡瓦，贾尼斯玛格丽特比梯，
申请(专利权)人：艾万根生物有限公司，
类型：发明
国别省市：AU[澳大利亚]