基于微流控芯片和G-四链体-血红素DNA酶的检测凝血酶用试剂盒及其制备方法和应用技术

本发明专利技术提供了基于微流控芯片和G‑四链体‑血红素DNA酶的检测凝血酶用试剂盒及其制备方法和应用，属于生物分子检测技术领域。所述检测凝血酶用试剂盒，包括以下组成：包被有功能化微球的微流控检测芯片；所述功能化微球为通过生物素‑亲和素系统将第一凝血酶核酸适配体修饰于微球表面；表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液；第一发夹探针试剂，第二发夹探针试剂和发光体系。本发明专利技术提供的试剂在检测凝血酶中的应用。所述试剂盒能够较好的解决微量医学分析技术领域或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。

Kit for detecting Thrombin Based on microfluidic chip and G- four chain heme DNA enzyme and its preparation method and Application

The invention provides a reagent box for detecting Thrombin Based on microfluidic chip and G four chain body heme DNA enzyme, as well as the preparation method and application, and belongs to the field of biological molecular detection technology. The reagent kit for detecting thrombin includes the following components: a microfluidic detection chip containing functional microspheres; the functional microspheres are modified by the biotin avidin system to modify the first thrombin aptamer to the surface of the microspheres; the surface is modified with a gold nanoparticle with second thrombin nuclear acid aptamers and initiating probes. Granular solution; first hairpin probe reagent, second hairpin probe reagent and luminescent system. The reagent provided by this invention is applied in the detection of thrombin. The kit can solve the difficult problem that the high throughput and high sensitivity characteristics are difficult to coexist in micro medical analysis technology field or micro invasive and non-invasive diagnosis field.

【技术实现步骤摘要】
基于微流控芯片和G-四链体-血红素DNA酶的检测凝血酶用试剂盒及其制备方法和应用
本专利技术属于微全分析系统
，具体涉及基于微流控芯片和G-四链体-血红素DNA酶的检测凝血酶用试剂盒及其制备方法和应用。
技术介绍
生物大分子是构成生命的基础物质，包括蛋白质、核酸、碳氢化合物等。目前，生物大分子分析的检测技术主要有：(1)微阵列芯片技术(Microarray)；(2)静态微流控阵列芯片技术；(3)常规分子生物学技术。但是这几类技术普遍存在需要昂贵、精密的检测设备，检测时间长且普遍灵敏度不理想，不能实现微量样品的高通量检测，成本较高等缺点，制约了这些技术在生物大分子临床诊断领域获得更加广泛及深入的应用(J.Mol.Diagn.,2017,19:697-710；WorldJGastrointestOncol.,2017,9:142-152；Eur.Rev.Med.Pharmacol.Sci.,2016,20:2558-2564；MethodsMol.Biol.,2017,1634:283-303)。动态微阵列是近年来发展的新兴研究领域，微流控微珠阵列芯片是动态微阵列研究领域中发展的一种新型芯片模式，它有机的将传统的微阵列芯片和微流控芯片结合起来，以功能化微球作为传感元件，以微流体作为试剂及样品传送方式实现微量检测(MicrochimicaActa,2015,182:661-669；Biosensorsandbioelectronics,2014,57:22-29；Biosensorsandbioelectronics,2013,42:23-30)。但是传统动态微阵列的开发仍然不能克服微量样品条件下高通量、高灵敏特性的难题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供基于微流控芯片和G-四链体-血红素复合物的检测试剂盒及其制备方法和应用，所述检测试剂盒具有高通量、高检测灵敏度的特性。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了基于微流控芯片和G-四链体-血红素复合物的检测凝血酶用试剂盒，包括以下组成：1)包被有微型小室中的功能化微球的微流控检测芯片；所述功能化微球为表面通过生物素-亲和素系统修饰有第一凝血酶核酸适配体的微球；所述第一凝血酶核酸适配体具体有如序列表SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；2)表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液；所述第二凝血酶核酸适配体具体有如序列表SeqIDNo.2所示的核苷酸序列；所述引发探针具体有如序列表SeqIDNo.3所示的核苷酸序列；3)第一发夹探针试剂；所述第一发夹探针具体有如序列表SeqIDNo.4所示的核苷酸序列；4)第二发夹探针试剂；第二发夹探针试剂具体有如序列表SeqIDNo.5所示的核苷酸序列；5)发光体系。优选的，所述微流控检测芯片设置有微型小室，微型小室的数量为2～15个；每个微型小室中包被有功能化微球的数量为10～25个。优选的，所述微型小室呈阵列分布，微型小室的数量为2～15个；所述微型小室为100～150μm宽、100～150μm长、30～50μm深。优选的，每个功能化微球表面修饰有3×107条第一凝血酶核酸适配体。优选的，每个金纳米颗粒表面修饰有第二凝血酶核酸适配体的数量为20～30条；每个金纳米颗粒表面修饰有引发探针的数量为200～300条。优选的，所述第二凝血酶核酸适配体与引发探针的摩尔比为1:8～12；所述金纳米颗粒液的浓度为23～24nmol/L。本专利技术提供了所述试剂盒的制备方法，包括包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法和表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒的制备方法；所述包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法，包括以下步骤：1)将亲和洗涤后的质量浓度为1％～3％的亲和素修饰微球液和0.3μmol/L生物素标记的第一凝血酶核酸适配体溶液混合孵育，洗涤，得到功能化微球；2)将所述步骤1)中功能化微球通过微球装载通道进入芯片中的微型小室中，固定，剥离微珠装载片基后，将试剂传送片基和微球固定阵列片基贴合，构建得到包被有功能化微球的微流控检测芯片；所述表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液的制备方法。包括以下步骤：A、在巯基修饰的第二凝血酶核酸适配体溶液、巯基修饰的引发探针溶液、二硫苏糖醇溶液和金纳米颗粒混合，在4℃下静置16h；B、向静置后的混合液逐滴加入缓冲液，混匀静置，25～35℃放置24h后，得到表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液。优选的，所述微球为聚苯乙烯；所述微球的粒径为15～25μm。优选的，所述步骤1)中亲和素修饰微球液和生物素标记的第一凝血酶核酸适配体溶液的体积比为42～45：2～4。优选的，所述步骤1)中亲和素修饰微球中每个微球上修改的亲和素的个数为0.8～1×107个。优选的，所述步骤1)中亲和洗涤用亲和洗脱液包含以下含量组分：20mmol/L的Tris，摩尔浓度为1mol/L的NaCl，摩尔浓度为1mmol/L的EDTA，质量浓度为0.0005％TritonX-100；所述亲和洗脱液的pH值为7.5。优选的，所述步骤A中巯基修饰的第二凝血酶核酸适配体、巯基修饰的引发探针的摩尔比为1:9～11。优选的，所述步骤B中混合液与缓冲液的体积比为8～9:1。优选的，所述缓冲液包括以下含量组分：摩尔浓度为2mol/LNaCL，摩尔浓度为50mmol/LTris-HCl。优选的，所述步骤B中静置后还包括固液分离、得到的沉淀物进行洗涤、沉淀和重悬，得到功能化的金纳米颗粒。优选的，洗涤用溶液包括以下含量组分：摩尔浓度为10mM的Tris-HCl，体积浓度为0.1％Tween20，摩尔浓度为0.15mmol/L的NaCL；所述洗涤用溶液的pH值为7.4。本专利技术提供了所述试剂盒或所述方法制备的检测试剂盒在检测凝血酶中的应用。优选的，包括以下步骤：1)将待测样品导入包被有功能化微球的微流控检测芯片中，洗脱，得到捕获有凝血酶的微流控检测芯片；2)将表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液导入捕获有凝血酶的微流控检测芯片中，洗脱，得到捕获有功能化金纳米颗粒的微流控检测芯片；3)将第一发夹探针试剂和第二发夹探针试剂导入所述捕获有功能化金纳米颗粒的微流控检测芯片中，洗涤后，继续依次导入氯化血红素溶液和化学发光体系，孵育；4)微流控检测芯片进行化学发光检测。本专利技术提供了基于微流控芯片和G-四链体-血红素复合物的检测凝血酶用试剂盒。以凝血酶为分析对象，以微流控动态微阵列技术为依托，以功能化金纳米颗粒表面杂交链式反应和G-四链体-血红素DNA酶化学发光新体系为信号放大手段，发展以微观条件下功能化微球为传感元件的高灵敏循环生物大分子分析新技术。该试剂盒的建立能够较好的解决微量医学分析
或微创、无创诊断领域中存在的微量样品条件下高通量、高灵敏特性难以并存的难题。该技术可实现疾病相关循环生物大分子的高灵敏检测、微创样品检测、可视化检测、不依赖复杂设备、成本低等特点，具有极大潜力发展为临床诊断技术。本专利技术提供的试剂盒，在凝血酶浓度在0.1pg/mL-100pg/mL之间时，呈良好的线性关系，回归方程为A＝0.799C凝血酶+17.71，线性相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
基于微流控芯片和G‑四链体‑血红素复合物的检测凝血酶用试剂盒，包括以下组成：1)包被有微型小室中的功能化微球的微流控检测芯片；所述功能化微球为表面通过生物素‑亲和素系统修饰有第一凝血酶核酸适配体的微球；所述第一凝血酶核酸适配体具体有如序列表Seq ID No.1所示的核苷酸序列；2)表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液；所述第二凝血酶核酸适配体具体有如序列表Seq ID No.2所示的核苷酸序列；所述引发探针具体有如序列表Seq ID No.3所示的核苷酸序列；3)第一发夹探针试剂；所述第一发夹探针具体有如序列表Seq ID No.4所示的核苷酸序列；4)第二发夹探针试剂；所述第二发夹探针试剂具体有如序列表Seq ID No.5所示的核苷酸序列；5)发光体系。

【技术特征摘要】
1.基于微流控芯片和G-四链体-血红素复合物的检测凝血酶用试剂盒，包括以下组成：1)包被有微型小室中的功能化微球的微流控检测芯片；所述功能化微球为表面通过生物素-亲和素系统修饰有第一凝血酶核酸适配体的微球；所述第一凝血酶核酸适配体具体有如序列表SeqIDNo.1所示的核苷酸序列；2)表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液；所述第二凝血酶核酸适配体具体有如序列表SeqIDNo.2所示的核苷酸序列；所述引发探针具体有如序列表SeqIDNo.3所示的核苷酸序列；3)第一发夹探针试剂；所述第一发夹探针具体有如序列表SeqIDNo.4所示的核苷酸序列；4)第二发夹探针试剂；所述第二发夹探针试剂具体有如序列表SeqIDNo.5所示的核苷酸序列；5)发光体系。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述微流控检测芯片设置有微型小室，微型小室的数量为2～15个；每个微型小室中包被有功能化微球的数量为10～25个。3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述微型小室呈阵列分布；所述微型小室的尺寸为100～150μm宽、100～150μm长、30～50μm深。4.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，每个功能化微球表面修饰有3×107条第一凝血酶核酸适配体。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，每个金纳米颗粒表面修饰有第二凝血酶核酸适配体的数量为20～30条；每个金纳米颗粒表面修饰有引发探针的数量为200～300条。6.根据权利要求1或5所述的试剂盒，其特征在于，所述第二凝血酶核酸适配体与引发探针的摩尔比为1:8～12；所述金纳米颗粒液的浓度为23～24nmol/L。7.权利要求1～6任意一项所述试剂盒的制备方法，其特征在于，包括包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法和表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒的制备方法；所述包被有功能化微球的微流控检测芯片的制备方法，包括以下步骤：1)将亲和洗涤后的质量浓度为1％～3％的亲和素修饰微球液和0.3μmol/L生物素标记的第一凝血酶核酸适配体溶液混合孵育，洗涤，得到功能化微球；2)将所述步骤1)中功能化微球通过微球装载通道进入芯片中的微型小室中，固定，剥离微珠装载片基后，将试剂传送片基和微球固定阵列片基贴合，构建得到包被有功能化微球的微流控检测芯片；所述表面修饰有第二凝血酶核酸适配体和引发探针的金纳米颗粒液的制备方法。包括以下步骤：A、在巯基修饰的第二凝血酶核酸适配体溶液、巯基修饰的引发探针溶液、二硫苏糖醇溶液和金纳米颗粒混合...

【专利技术属性】
技术研发人员：张何，赵智粮，傅昕，
申请(专利权)人：湖南工程学院，
类型：发明
国别省市：湖南,43