用于表征基于时间的肝毒性的方法技术

提供表征测试化合物基于时间的肝毒性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括a)将包含肝细胞的第一体外培养物与测试化合物温育第一培养时间；b)测量所述测试化合物在所述第一培养时间内对第一体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性；c)将包含肝细胞的第二体外培养物与测试化合物温育长于第一培养时间的第二培养时间；d)测量所述测试化合物在第二培养时间内对第二体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性；和e)将所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性与所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比较以由此表征所述测试化合物基于时间的肝毒性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于表征基于时间的肝毒性的方法简介新药开发中的一个主要障碍是推进能够展示足以获得监管部门批准的效力和安全性的药物候选。有前景的候选经常在临床前或临床阶段失败。尽管存在许多原因使药物候选在开发过程中流失，一个最常见的原因涉及潜在肝脏毒性的安全相关发现。本领域需要减少由于发现肝脏毒性导致临床和后期临床前失败而产生的开销、减少鉴别安全相关问题的时间和加速通过基础发现研究鉴别的候选化合物的决策。目前采用的众多体外研究支持以最高成功概率选择候选，但在检测肝毒性上存在缺陷。肝毒性可由一种或多种机制导致，包括基因毒性(诱变、诱裂)、CYP抑制(包括时间抑制)、CYP诱导、G-SH加合物形成、与蛋白的共价结合和hERG电流抑制、脂肪变性、肉芽肿、形成反应性代谢物和胆汁淤积。使用常规肝细胞系统的体外细胞毒性评估甚至不足以充分预测体内肝毒性可能性，其包括提供短期或急性测试的基于细胞的体外模型，经常使用温育，获得仅24小时或更短的短期时间点的数据，或仅获得在一个该时间点的数据。事实上，相关领域的众多毒理学家认为源自如此短期、“急性”体外测试的数据在临床前决策中具有很少或没有可操作的价值，且经常将药物化合物继续推进入随后(且越来越昂贵)的开发阶段，尽管这些模型可生成阳性肝毒性响应的发现(有时在本领域称为“肝脏信号”)。因此，本领域需要表征肝毒性的新型和改进的方法和系统。本专利技术满足了这些和其他需求。概述目前体外系统局限性的原因之一在于其一般因为有限和/或递减的代谢能力而限于24小时的读取。本专利技术利用在培养中能够在体外维持功能性达延长时间的肝细胞培养物，所述时间可达例如14、21或28小时。部分基于使用该系统，本专利技术提供包括在1、2、3、4、5、6、7或更多天，或14天或更长时间的多个时间点测量培养物中肝毒性的方法。在一些实施方案中，提供的方法允许以相对使用本领域的方法所实现的有所改进的方式预测测试化合物的肝毒性潜力。在一些实施方案中，所述方法可用于量化时间上不同、连续的点生成的毒性的测量和预估间的关系。通过比较在24小时测量的测试化合物的毒性(其中毒性在第7天或在第14天测量)，发现了毒性随时间的变化提供了非常有意义的工具来在体内评估测试化合物在体内的肝毒性。因此，在一些实施方案中，本专利技术提供表征测试化合物基于时间的肝毒性的方法。在一些实施方案中，所述方法包括a)将包含肝细胞的第一体外培养物与测试化合物温育第一培养时间；b)测量所述测试化合物在所述第一培养时间内对第一体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性；c)将包含肝细胞的第二体外培养物与测试化合物温育长于第一培养时间的第二培养时间；d)测量所述测试化合物在第二培养时间内对第二体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性；和e)将所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性与所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比较以由此表征所述测试化合物基于时间的肝毒性。在一些实施方案中，所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性大于所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性且所述测试化合物鉴别为展示基于时间的肝毒性。在一些实施方案中，所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性大至少预定义的阈值且所述测试化合物鉴别为展示基于时间的肝毒性。在一些实施方案中，所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性未比所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性大至少预定义的阈值且所述测试化合物鉴别为不展示基于时间的肝毒性。在一些实施方案中预定义的阈值选自约2、约3、约4、约5、约6、约7、约8、约9或约10。在一些实施方案中，预定义的阈值选自2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，预定义的阈值为2至5、3至5、2至4、2至6、4至8或5至10。在一些实施方案中，第一和第二体外培养物包含分离的肝细胞。在一些实施方案中，所述分离的肝细胞基本上分散在固体基质的表面上。在一些实施方案中，所述肝细胞为原代肝细胞。在一些实施方案中，所述肝细胞为干细胞衍生的。在一些实施方案中，第一和第二体外培养物进一步包含至少一种限定的基质细胞类型。在一些实施方案中，第一和第二体外培养物包含至少一种以下述微型模式构造的培养的肝细胞：含有肝细胞和至少一种其他细胞类型并粘附于基质材料的微型模式；肝细胞以细胞的球形构造成簇的微型模式，其封装或未封装于培养基液滴中或粘附或未粘附于微珠；肝细胞贮存在“三明治”培养物中的微型模式，其中肝细胞稳定于基底和胶原蛋白或其他凝胶或蛋白质的覆盖层间；和肝细胞嵌入膜、晶格、支架或天然存在或人工材料中或在其上的微型模式，所述人工材料包括但不限于含有源自海藻酸盐的材料的支架或晶格、人工半透膜或含有培养的毛细血管的床体。在一些实施方案中，第一培养时间为12小时至2天。在一些实施方案中，第一培养时间是1天。在一些实施方案中，第二培养时间为3至28天。在一些实施方案中，第二培养时间为7至14天。在一些实施方案中，第一培养时间是1天且所述第二培养时间为7天或14天。在一些实施方案中，“x”天的培养时间为至少“x”天的培养时间。在一些实施方案中，“x”天的培养时间为至少约“x”天的培养时间。在一些实施方案中，“x”天的培养时间为约“x”天的培养时间。在一些实施方案中，所述方法进一步包括至少一个第三培养时间，并a)将包含肝细胞的第三体外培养物与测试化合物温育第三培养时间，所述第三培养时间比第一和第二培养时间更长；b)测量所述测试化合物在所述第三培养时间内对第三体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第三培养时间内的肝毒性；和c)将第一、第二或第一和第二培养时间内测试化合物的肝毒性与在第三培养时间内测试化合物的肝毒性进行比较以由此表征测试化合物基于时间的肝毒性。在所述方法的一些实施方案中，比较包括实施数学运算，其包括确定两个或多个测量量之间的算术比值，或利用积分或微积分的方法或利用概率、随机或模拟形式的测量或计算模型确定两侧测量的量之间的关系。在一些实施方案中，步骤a)包括将包含肝细胞的多种第一体外培养物与所述测试化合物温育第一培养时间。在一些实施方案中，步骤c)包括将包含肝细胞的多种第二体外培养物与所述测试化合物温育第二培养时间。在一些实施方案中，步骤b)包括确定所述化合物在第一培养时间内的TC50。在一些实施方案中，步骤d)包括确定所述化合物在第二培养时间内的TC50。在一些实施方案中，步骤b)包括确定所述化合物在第一培养时间内的TC50，其中步骤d)包括确定所述化合物在第二培养时间内的TC50，且其中步骤e)包括确定所述化合物在第一培养时间内的TC50与所述化合物在第二培养时间内的TC50的比率以定义所述测试化合物基于时间的毒性评分。附图简述图1显示在本专利技术的大鼠、狗和灵长类肝细胞-基质细胞共培养物中I期酶功能是持久的。在所示时间点测量了7-羟基香豆素形成的速率。不同模式对于不同物种是明显的；然而，在每种情况中，I期酶都是功能持久的。自肝细胞接种日，大鼠和狗具有至少35天的I期活性且灵长类具有至少22天的I期活性。图2显示在本专利技术的大鼠、狗和灵长类肝细胞-基质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表征测试化合物基于时间的肝毒性的方法，其包括：a)将包含肝细胞的第一体外培养物与测试化合物温育第一培养时间；b)测量所述测试化合物在所述第一培养时间内对第一体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性；c)将包含肝细胞的第二体外培养物与测试化合物温育长于第一培养时间的第二培养时间；d)测量所述测试化合物在第二培养时间内对第二体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性；和e)将所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性与所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比较以由此表征所述测试化合物基于时间的肝毒性。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.03.20 US 62/136,4281.一种表征测试化合物基于时间的肝毒性的方法，其包括：a)将包含肝细胞的第一体外培养物与测试化合物温育第一培养时间；b)测量所述测试化合物在所述第一培养时间内对第一体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性；c)将包含肝细胞的第二体外培养物与测试化合物温育长于第一培养时间的第二培养时间；d)测量所述测试化合物在第二培养时间内对第二体外培养物的肝细胞的至少一种细胞毒性效应以由此定义所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性；和e)将所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性与所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比较以由此表征所述测试化合物基于时间的肝毒性。2.权利要求1的方法，其中所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性大于所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性且所述测试化合物鉴别为展示基于时间的肝毒性。3.权利要求1的方法，其中所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性比所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性大至少预定义的阈值且所述测试化合物鉴别为展示基于时间的肝毒性。4.权利要求1的方法，其中所述测试化合物在第二培养时间内的肝毒性未比所述测试化合物在第一培养时间内的肝毒性大至少预定义的阈值且所述测试化合物鉴别为不展示基于时间的肝毒性。5.权利要求1的方法，其中所述第...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·弗里德曼，J·麦克唐纳，E·诺维克，
申请(专利权)人：休雷尔公司，
类型：发明
国别省市：美国,US