检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸及其制备与应用制造技术

本发明专利技术公开检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸及其制备与应用，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，其中金标垫上含有胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体，硝酸纤维素膜上有用PLMP蛋白多克隆抗体预包被的检测线，用羊抗兔IgG溶液预包被的质控线，制备的胶体金免疫试纸特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100%，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为10

【技术实现步骤摘要】
检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸及其制备与应用
本专利技术主要涉及分子生物学
，具体地说，本专利技术涉及多克隆抗体制备的

技术介绍
美洲幼虫腐臭病(Americanfoulbrood，AFB)，是由幼虫芽孢杆菌(Paenibaciluslarvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫及蜂蛹的一种急性、烈性传染病。幼虫芽孢杆菌主要致病因子是一些胞外分泌的蛋白酶，研究表明，这些蛋白酶为含锌的金属蛋白酶(Paenibaciluslarvaemetaloproteases，PLMP)，参与幼虫退化。此病危害严重，毁灭性强且只感染蜜蜂幼虫，在感染前期，幼虫体色由正常的珍珠白变为棕黄、褐色甚至黑褐色，房盖凹陷，潮湿色暗；在感染后期，幼虫死亡后的尸体能拉出2cm-3cm的细丝，散发鱼腥臭味，最后以黑褐色的鳞片状物紧贴在巢房壁。P.larvae芽孢抵抗力强，能抵抗热、化学物质，在高温干燥等恶劣环境下能存活多年。该病一旦发生极易造成蜂群衰弱及蜂群死亡。该病最初于英国发生，后传至欧美，现遍及全世界，世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。中国是养蜂大国，也是最大的蜂产品生产和出口国，该病对我目前对AFB的鉴国养蜂业的发展以及蜂产品质量已造成严重影响。目前对AFB的鉴定方法主要包括病原的分离鉴定和PCR方法，这些方法由于耗时、需特殊仪器设备和专业技术人员等，不利于现场快速诊断。为解决养蜂生产因具有流动性、分散性、野外作业等特点给蜂病诊断和防控带来的现实困难，因此建立一种准确、灵敏、利于现场快速诊断AFB的方法具有重要意义。尚未见关于采用免疫学方法进行检测AFB的报道，免疫分析方法包括酶联免疫吸附法(ELISA)和胶体金免疫层析法(GICA)，具有灵敏度高、特异性好、成本低、操作方便等特点，适于大批量样品筛选。GICA作为一种新的免疫学检测方法，既有免疫学方法的特异性，又有简便快速、不需仪器的特点，其在医学、动植物检疫、食品检测等多领域已得到了广泛应用。开发检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金试纸条有助于幼虫芽孢杆菌快速、准确的检测。
技术实现思路
为了解决现有技术中蜜蜂幼虫芽孢杆菌的检测方法耗时较长，操作技术要求较高，不利于现场快速检测的问题，本专利技术旨在于提供一种检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸及其制备与应用，建立一种准确、灵敏、利于现场快速检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的方法。本专利技术通过以下技术方案实现的:本专利技术具体提供一种检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，其中金标垫上含有胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体，硝酸纤维素膜上有用PLMP蛋白多克隆抗体预包被的检测线(T线)，用羊抗兔IgG溶液预包被的质控线(C线)。优选的，胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体的标金量为30μg/mL。优选的，检测线的抗体包被浓度为1.2mg/mL，抗体包被体积为1.5μL。优选的，质控线的抗体包被浓度为1.0mg/mL，抗体包被体积为1.5μL。同时，本专利技术提供上述检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸的制备方法，具体采用以下技术步骤：(1)制备胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体：吸取10mL胶体金溶液于已经酸洗、硅化处理好的离心管中，置于涡旋振荡器上，调至1500r/min，逐滴加入0.2mol/L的K2CO3溶液150μL，同时振荡混匀以调至pH9.0，逐滴加入240μg的PLMP蛋白多克隆抗体，1500r/min振荡混匀10min，随后加入10％的BSA使其终浓度为1％，振荡混匀后静置30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，1000r/min离心10min后取上清液，上清液置于4℃，5000r/min离心10min，将上清液和沉淀分开，收集沉淀，上清液再置于4℃,10000r/min离心30min，收集两次沉淀即是纯化标记好的胶体金抗体复合物，取体积为最初未经纯化的金标记抗体溶液体积的1/10为胶体金重悬液用量，将其加入至两次收集的沉淀中，重悬沉淀即为纯化好的金标抗体，于4℃保存。(2)金标垫的制备：用干净的剪刀将金标垫裁剪成0.7cm×10cm大小的长条，将裁剪好的金标垫浸泡在金标垫处理液中30min，4℃过夜干燥，将已经纯化好的金标抗体溶液均匀滴于处理好的金标垫上，悬空平放，于室温下自然干燥，除去多余水分，而后置于4℃风干，密封保存。(3)检测线和质控线的制备：取两块经酸洗硅化处理过的玻璃片，移液器吸取PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗均匀涂于玻璃片的侧面，涂完后玻璃片侧面印于NC膜上，检测线与质控线间隔0.5cm，将PLMP蛋白多克隆抗体、羊抗兔IgG二抗包被在硝酸纤维素膜上的检测区和质控区，包被之后于室温自然干燥。(4)试纸条组装：将底板裁剪成宽为3.2cm/条，先将硝酸纤维素膜底面粘贴于底板上，经抗体包被后的金标垫裁剪为6.0cm×0.7cm压硝酸纤维素膜2mm平铺粘贴在底板上，剪样品垫6.0cm×1.8cm压金标垫2mm粘贴在底板上，剪吸水垫6.0cm×1.7cm压硝酸纤维素膜2mm粘贴在底板上，在金标垫与样品垫连接处用衔接胶带粘住，压紧各层，用剪刀将组装好的试纸条裁切呈宽为3mm的小条，密封干燥置于4℃保存。优选的，本专利技术采用的PLMP蛋白多克隆抗体由PLMP蛋白注射免疫家兔制备获得。进一步，本专利技术还提供上述检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸在检测蜂蜜、蜂蜡、成蜂和菌液中幼虫芽孢杆菌的应用方法，具体采用以下技术步骤：(1)样品前处理：(a)蜂蜜：取5g蜂蜜充分溶解于40mL去离子水中，吸取100μL溶液，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。(b)蜂蜡或成蜂：将蜂蜡或成蜂放入破壁管中，加入适当的双蒸水，固定在破壁仪上，进行破碎。破碎后取上清100μL进行检测。(c)菌液：无需处理，直接取100μL菌液样品，滴加到试纸条样品垫上，进行检测。(2)用胶体金层析试纸条检测：将所取液体滴到样品垫上，室温下作用10-15min。(3)结果判定(a)阳性：质控线、检测线均呈现红色条带，说明样本中有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。(b)阴性：检测线不出现红色条带，质控线呈现红色条带，说明样本中没有幼虫芽孢杆菌PLMP蛋白存在。(c)失效：如果检测线、质控线均不出现红色条带或仅有检测线出现红色条带，说明试纸条失效。通过实施本专利技术的技术方案，可以达到以下有益效果:(1)本专利技术提供的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，特异性强，对阴性菌液均无检出情况，特异度可达100％，灵敏性较好，对幼虫芽孢杆菌的菌液及阳性样品最低检出浓度分别为105CFU/mL和106CFU/mL。(2)本专利技术提供的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸检测重复性好，性能稳定，保存期可以达到3个月，使用方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用。附图说明图1显示为检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫层析试纸模式图。图2显示为实施例五中胶体金免疫层析试纸条的结果判断示意图。图3显示为试纸条特异性测试结果。其中试纸条1为幼虫芽孢杆菌菌液，试纸条2为蜂房链球菌菌液，试纸条3为蜜蜂败血杆菌菌液，试纸条4为蜜蜂哈夫尼肠杆菌菌液，试纸条5为双蒸水。具体实本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述的金标垫上含有胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体。

【技术特征摘要】
1.检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，具体包括样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸水垫和底板，所述的金标垫上含有胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体。2.如权利要求1所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，所述的硝酸纤维素膜上有用PLMP蛋白多克隆抗体预包被的检测线，用羊抗兔IgG溶液预包被的质控线。3.如权利要求1所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，所述的胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体的标金量为30μg/mL。4.如权利要求2所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，所述的检测线的抗体包被浓度为1.2mg/mL，抗体包被体积为1.5μL。5.如权利要求2所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸，其特征在于，所述的质控线的抗体包被浓度为1.0mg/mL，抗体包被体积为1.5μL。6.如权利要求1所述的检测蜜蜂幼虫芽孢杆菌的胶体金免疫试纸的制备方法，其特征在于，具体采用以下技术步骤：(1)制备胶体金标记的PLMP蛋白多克隆抗体：吸取10mL胶体金溶液于已经酸洗、硅化处理好的离心管中，置于涡旋振荡器上，调至1500r/min，逐滴加入0.2mol/L的K2CO3溶液150μL，同时振荡混匀以调至pH9.0，逐滴加入240μg的PLMP蛋白多克隆抗体，1500r/min振荡混匀10min，随后加入10％的BSA使其终浓度为1％，振荡混匀后静置30min；将标记好的胶体金抗体溶液于4℃，1000r/min离心10min后取上清液，上清液置于4℃，5000r/min离心10min，将上清液和沉淀分开，收集沉淀，上清液再置于4℃,10000r/min离心30min，收集两次沉淀即是纯化标记好的胶体金抗体复合物，取体积为最初未经纯化的金标记抗体溶液体积的1/10为胶体金重悬液用量，将其加入至两次收集的沉淀中，重悬沉淀即为纯化好的金标抗体，于4℃保存；(2)金标垫的制备：用干净的剪刀将金标垫裁剪成0.7cm×10cm大小的长条，将裁剪好的金标垫浸泡在金标垫处理液中30min，4℃过夜干燥，将已经纯化好的金标抗体溶液均匀滴于处理好的金标垫上，悬空平放，于室温下自...

【专利技术属性】
技术研发人员：王振宝，季新成，员丽娟，何晓杰，雷程红，葛婷，叶尔保勒，叶尔兰·阿不都买金，阿斯喀·夏热甫汉，哈森，
申请(专利权)人：伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心，新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心，新疆农业大学，
类型：发明
国别省市：新疆,65