一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体公开了一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法。本发明专利技术建立的检测方法，由于加入了非吸附型纳米颗粒，在超速离心过程中可通过其表面非特异性吸附的形式吸附低密度病毒颗粒，使得病毒颗粒更多地聚集到铜网上，检测下限由原先的1×10

【技术实现步骤摘要】
一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法
本专利技术属于生物
，具体的，本专利技术涉及一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法。
技术介绍
一、细胞培养的外源因子污染生物制品是采用生物技术制备而成的具有生物活性的药品、疫苗、抗体、生化产品等的总称，其生产工艺复杂且受多种因素影响，生产过程中使用的各种材料来源复杂，可能污染细菌、真菌、支原体和病毒等外源因子，引起产品安全性问题。其中生物制品生产用细胞是生物制品生产的一个关键要素，目前国内外许多生物制品均是以细胞基质材科为基础生产生物制品。同时，使用细胞基质生产生物制品过程及其复杂，加之周期长、易污染等客观因素，导至外源因子污染成为影响生物制品生物安全性的一个极其重要的因素。因此，对生物制品生产用细胞基质及过程进行严格的质量控制，排除外源因子污染，是生物制品生产的重要环节。鉴于生物制品的应用对象是人体免疫或疾病治疗。因此，生物制品终产品的质量与生物安全性密切相关，是各国药品管理机构最为关注的问题，各国药典中最严格控制的指标之一。生物制品生产用细胞基质需建立各级细胞库，细胞库质量是产品质量的上游保证，《中华人民共和国药典，三部，2015版》及《生物制品通则》规定各级细胞库及终产品均需要进行外源因子污染检定，检测结果应无外源因子污染。目前，中国药典规定对于细胞外源因子污染的检测以培养法为主，细菌、真菌、支原体因其生物学持性所至，用多种培养方法联合检测基本能检测出所有的污染物。而对于细胞内、外源病毒污染的检测，目前采用的体外培养观察加红细胞吸附法、动物体内及鸡胚接种法等均为间接的检测方法，不仅检测周期长，操作复杂且易受干扰，同时覆盖的范围窄，对某些特定病毒，且病毒密度比较低的样品检测技术更为复杂多样。因此，急需一种能够快速、直观观察污染的病毒颗粒形态，且又能同时对低密度病毒进行精确定量的方法，解诀细胞内、外源病毒污染的精确定量检测问题。二、负染色电镜技术与病毒学研究电子显微镜技术在自然科学各个领域中都发挥了重要的作用，尤其是生物学、材料科学、医药卫生等相关学科，更是不可缺少的工具。负染色电子显微镜技术在病毒学研究中常规使用，尤其对病毒形态观察、病毒分类和病毒诊断领域起非常重要的作用。对于特征性病毒，可直观地立刻做出判定，对于特征不太强的病毒，可结合其它指标综合判定。负染色电子显微镜定量实验(QuantitationofViralContaminantsbyNegativeStainElectronMicroscopy)是一项运用负染色电子显微镜观察待检测样品中是否含有病毒颗粒，同时通过直接计数病毒颗粒，对样品中的病毒浓度进行定量的技术。上世纪70～80年代该技术已被Gelderblometal(1978)和Hammondetal(1981)用于病毒的定量检测，基本流程是纯化后的病毒与电镜铜网直接超速离心，电子显微镜视野下拍照并直接对病毒颗粒计数。由于当时的实验条件所限，加之电子显微镜技术参数设置差强人意，至使病毒定量误差较大，难于推广应用。近年来，也有少数新技术、新方法问世，但仅限于对高密度(106-7)以上的病毒进行定量，对低密度(103-5)的病毒定量仍无能为力。而对低密度(103-5)的病毒定量，正是细胞培养中内、外源病毒污染定量检测期待的关键技术。纳米颗粒是一种人工制造的、大小不超过100纳米的微型颗粒。它的形态可以是乳胶体、聚合物、陶瓷颗粒、金属颗粒和碳颗粒。近年来，纳米颗粒越来越多地应用于生物医学、药物载体及生物活性大分子吸附中。直接用于人体的纳米颗粒依其形状、大小、原始材料、表面大小、带电荷以及用量、作用时间等方面所表现出的生物毒性差异显著，需经严格的毒理试验评估后方可使用。而用于离体试验的标准参照物，更多关注纳米颗粒的大小形状，表面结构及带电荷状态，相溶牲等，对纳米颗粒的选择余地会更大。纳米颗粒根据表面基团功能的不同，可分为特异性吸附型和非特异性吸附型，前者为特异性稳定吸附，是一种典型的生物学效应，后者是一种不稳定的吸附聚集现象，产生的是物理吸附作用，结合力不够牢固，随着时间推移，条件的改变，吸附的物体会缓慢脱落，形成分散状态。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术提供了一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法，由于引入纳米颗粒作为负染色电子显微镜定量观察中的标准参照物，显著提升病毒定量的灵敏度、精确度，可对待检细胞培养收获液中低密度(103-5)的病毒进行精确定量，其定量精确度甚至与标准的生物学测定法(病毒滴度测定法)相当。为了达到上述目的，本专利技术采取以下技术措施：一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括下述步骤：1)预处理：按照常规离心方式去除待测样品中的细胞碎片和杂质，经超速离心浓缩后的病毒，用MEM或PBS溶解；2)上样检测：将经过步骤1)预处理的待测样品与纳米颗粒混合，将铜网置于该混合物中后超速离心；将铜网取出，清洗后的铜网磷钨酸负染，电镜观察；3)计数：若发现病毒样颗粒，则对不同网格中的纳米颗粒或病毒样颗粒进行计数，每个网格至少观察5个视野，结果中会给出网格中纳米颗粒和病毒样颗粒各自的数目，并根据两者的比例关系计算出检测样品中病毒样颗粒的浓度。以上所述的方法中，优选的，步骤1)的步骤包括：1、先取待检测样品5～10ml，转入15ml离心管中，于4℃，3000g离心10分钟。2、将离心好的上清转入新的15ml离心管中，于4℃，6000g离心20分钟。3、将离心好的上清转入新的15ml离心管中，于4℃，10000g离心30分钟，上清备用。4、取3～5ml备用上清置于超速离心管中，补满离心管总体积6ml。在ThermoWX100(T8100转子)冷冻超速离心机中4℃，72000g离心2～4小时。5、弃上清，每管加入500～1000ul无血清MEM培养基或PBS重悬，于冰上溶解4小时或过夜，收集样品于1.5mlEP管中，冻于-80℃冰箱备用。以上所述的方法中，优选的，所述的纳米颗粒的直径为100nm；以上所述的方法中，优选的，步骤2)中超速离心的速度为100,000×g～120,000×g，离心时间为5～10min；以上所述的方法中，优选的，所述的磷钨酸的浓度为3％(w/v)以上所述的方法中，优选的，所述的铜网为200目；以上所述的方法中，优选的，步骤2)中，待测样品与纳米颗粒混合时，待测样品中的病毒数与纳米颗粒的比值范围是1：1～1：9；以上所述的方法中，优选的，所述的纳米颗粒的材质为合成乳胶。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、检测周期短，成本低廉：对比常规方法(体外体内培养法)长达2～4周的检测周期，负染色电子显微镜定量法仅需三个工作日就能完成样品处理、上样检测及结果分析的完整周期，大大节约了时间成本和人力成本，能够高效、快速的完成样品的病毒污染检测工作，同时，所用试剂(纳米颗粒标准品，染色液等)性状稳定，检测成本低。2、直观化、可视化、精确定量：对比传统的间接培养检测法，负染色电镜检测法能够直观的在电镜下观察到各种特异的病毒样颗粒形态，实现可视化操作；同时引入已知浓度的非吸附型纳米颗粒标准物作为参照，在可视化的基础上实现对细胞培养收获液中病毒样颗粒的直接计数，通过计算获得样品中病毒的定量，即每m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括下述步骤：1）预处理：按照常规离心方式去除待测样品中的细胞碎片和杂质，经超速离心浓缩后的病毒，用MEM或PBS溶解；2）上样检测：将经过步骤1）预处理的待测样品与纳米颗粒混合，将铜网置于该混合物中后超速离心；将铜网取出，清洗后的铜网磷钨酸负染，电镜观察；3）计数：若发现病毒样颗粒，则对不同网格中的纳米颗粒或病毒样颗粒进行计数，每个网格至少观察5个视野，结果中会给出网格中纳米颗粒和病毒样颗粒各自的数目，并根据两者的比例关系计算出检测样品中病毒样颗粒的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种细胞培养收获液中病毒颗粒的电镜定量检测方法，包括下述步骤：1）预处理：按照常规离心方式去除待测样品中的细胞碎片和杂质，经超速离心浓缩后的病毒，用MEM或PBS溶解；2）上样检测：将经过步骤1）预处理的待测样品与纳米颗粒混合，将铜网置于该混合物中后超速离心；将铜网取出，清洗后的铜网磷钨酸负染，电镜观察；3）计数：若发现病毒样颗粒，则对不同网格中的纳米颗粒或病毒样颗粒进行计数，每个网格至少观察5个视野，结果中会给出网格中纳米颗粒和病毒样颗粒各自的数目，并根据两者的比例关系计算出检测样品中病毒样颗粒的浓度。2.根据权利要去1所述的方法，所述的步骤1）的步骤包括：1）、先取待检测样品5~10ml，转入15ml离心管中，于4℃，3000g离心10分钟；2）、将离心好的上清转入新的15ml离心管中，于4℃，6000g离心20分钟；3）、将离心好的上清转入新的15ml离心管中，于4...

【专利技术属性】
技术研发人员：袁冰，张智，李姣，
申请(专利权)人：武汉珈创生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北,42