本发明专利技术公开了一种微生物法在有机相中合成没食子酸丙酯的方法。方法的步骤如下：１）将黑曲霉孢子培养得到的菌丝体收集过滤，用０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液冲洗，在０．０１～０．２ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ２．２～５．８缓冲溶液中平衡后过滤，得到含水量为６０～８０％（ｗ／ｗ）的菌丝体；２）在有机溶剂苯体系中，每升有机溶剂中加入０．０６～０．１Ｌ的正丙醇和４～１０ｍｍｏｌ的没食子酸，再在每升有机溶剂中加入２０～５０ｇ的上述黑曲霉菌丝体，在搅拌速度１５０～２２０ｒｐｍ和反应温度２０～５０℃下进行生物催化反应，反应时间为４８～９６ｈ。本方法建立了黑曲霉产单宁酶的发酵培养基，利用该产单宁酶的黑曲霉菌丝体作为生物催化剂，不使用传统的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分离纯化过程，降低了生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种。
技术介绍
生物转化属于化学和生物学的交叉领域，生物催化剂和反应介质是生物转化的两大要素。生物催化剂工程运用发酵技术或从动植物中分离提取获得大量的酶，其研究经历了自由酶、固定化酶和细胞的过程；介质工程则为生物催化剂作用过程提供理想的溶剂体系，传统上以水为溶剂体系，自Klibanov等开创有机相酶催化反应以来，有机溶剂介质体系得到了广泛的研究。单宁酶全称为单宁酰基水解酶(tannin acyl hydrolase，EC 3.1.1.20)，是一种细胞膜结合酶，可分泌到胞外，能水解水解性单宁和没食子酸酯类中的酯键和缩酚酸键，从而生成没食子酸和葡萄糖及相应的醇类化合物。单宁酶主要产生于真菌类曲霉属(Aspergillus)和青霉属(Penicillium)的微生物，尤其是曲霉属的黑曲霉(Aspergillus.niger)和米曲霉(Aspergillus oryzae)。另外，在酵母、细菌和植物中也有产单宁酶的研究报道。没食子酸酯类是没食子酸的重要衍生物之一，能促进纤维蛋白和血栓的溶解、扩张血管、增加冠动脉血流量及有效抑制血小板的凝集，广泛地应用于治疗心脑血管疾病。同时，没食子酸酯类还可清除体内的氧自由基，对炎症、病毒性疾病、细菌感染性疾病、胃溃疡、辐射损伤、过敏及老年性痴呆等均有一定的治疗和防治作用，在医药领域中具有广泛而重要的应用前景。其中没食子酸丙酯(propyl gallate，PG)表现的尤为突出。PG是FAO/WHO组织批准的油溶性合成食品抗氧化剂，对人体无任何毒副作用，是国际上通用的食品抗氧化剂。PG的医药商品名为“通脉酯”，是治疗心脑血管疾病的一类新药，具有抗血小板聚集、增强纤维蛋白和血栓溶解、扩张血管及增加冠动脉血流量等疗效。同时它还能清除体内氧自由基、预防乳腺癌，对Lrewis肺癌具有抑制和抗转移作用。目前，PG是由没食子酸和丙醇酯化反应而成，合成方法可分为化学合成法和生物合成法，在工业化生产领域中化学合成法一直是占主导地位。由于没食子酸中苯环及其上的羧基和两个酚羟基形成共轭大π键，其反应活化能很高，因此其酯化反应所需的条件较为苛刻。鉴于此，化学合成法一般是以离子交换树脂、浓硫酸或固体酸等作为催化剂，将没食子酸与过量的丙醇回流脱水制备成PG。该生产过程不仅制备时间长、产率不高，而且浓硫酸具有强氧化性，易使具有邻二酚结构的没食子酸发生氧化，生成大量的副反应产物，且还会严重腐蚀生产设备。而相比之下，采用生物合成法酯化合成PG就容易得多，而且反应条件温和，不存在副反应等诸多问题。1952年Toch和Hensler首次在水相中利用单宁酶(tannase EC 3.1.1.20)催化合成没食子酸甲酯和乙酯，开创了生物合成桔酸酯的先河. 随着20世纪70～80年代中有机相酶(细胞)促反应研究的蓬勃兴起，迄今为止，该研究领域中已积累大量的研究成果和建立起较为完善的理论基础，并显示出水相酶促反应所无法比拟的优势，尤其是有机相中反应平衡点可向合成方向移动，以及依赖于水的副反应(水解反应)显著减少，这无疑为有机相中进行合成PG的酯化反应创造条件。1985年，Weetal首次用固定的单宁酶成功催化合成没食子酸丙酯和没食子酸戊酯，168h酯化率分别为41.4％和78％，同年Weetal取得了没食子酸丙酯合成的专利，1989年Gaathon等利用反胶束固定化单宁酶合成没食子酸丙酯，90h的产率为51％，但是由于反胶束物化性能不稳定，很难放大和工业化生产。至今对于生物法合成桔酸酯的研究仍在不断探索中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种。方法的步骤如下1)将黑曲霉孢子培养得到的菌丝体收集过滤，用0.85％(w/v)NaCl溶液冲洗，在0.01～0.2mol/L pH 2.2～5.8缓冲溶液中平衡后过滤，得到含水量为60～80％(w/w)的菌丝体。所述的缓冲溶液pH2.2～3.6的为甘氨酸—盐酸缓冲液，pH3.6～5.8的为乙酸—乙酸钠缓冲液(配制方法见《生物化学实验原理和方法》李建武等编，北京大学出版社，1994年，p404)。2)在有机溶剂苯体系中，每升有机溶剂中加入0.06～0.1L的正丙醇和4～10mmol的没食子酸，再在每升有机溶剂中加入20～50g的上述黑曲霉菌丝体，在搅拌速度150～220rpm和反应温度20～50℃下进行生物催化反应，反应时间为48～96h。上述的黑曲霉孢子培养方法为将CGMCC保藏号No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接种到黑曲霉菌种保藏培养基上，在30℃下培养5天，然后将萌发的黑曲霉孢子接种到300L的发酵培养基中，其中孢子浓度为105个/ml，在搅拌速度180rpm和培养温度30℃条件下培养72h。黑曲霉菌种保藏培养基为(单位％(w/v))单宁酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，琼脂6％。黑曲霉发酵培养基为(单位％(w/v))单宁酸1.0～4.0％，可溶性淀粉0.2～0.4％，蔗糖0.3～0.8％，葡萄糖0.1～0.3％，豆饼粉0.5～1.0％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。本专利技术的优点文献报道的方法均使用游离单宁酶或者固定化单宁酶作为生物催化剂，但是曲霉属的单宁酶为胞内酶，分布在真菌的细胞壁与细胞膜之间，结合得非常牢固，相当于固定在细胞中，导致单宁酶分离纯化过程中破壁取酶非常困难，而本方法建立了黑曲霉产单宁酶的发酵培养基，利用该产单宁酶的黑曲霉菌丝体作为生物催化剂，不使用传统的自由酶或者固定化酶，省去了酶的分离纯化过程，而且完整细胞具有对有机溶剂的耐受性更高，易于回收等优点，因此大大降低了生产成本；通过有机介质工程，将黑曲霉菌丝体加入有机介质体系中催化酯化反应，在温和的反应条件下，没食子酸丙酯反应产率达到30～60％。至今国内外仍未有文献报道直接利用产单宁酶的黑曲霉菌丝体作为催化剂在有机介质体系中合成没食子酸丙酯。具体实施例方式实施例1将CGMCC保藏号No.3.315的黑曲霉(Aspergillus niger)接种到黑曲霉菌种保藏培养基上，在30℃下培养5天，然后将萌发的黑曲霉孢子接种到300L的发酵培养基中，其中孢子浓度为105个/ml，在搅拌速度180rpm和培养温度30℃条件下培养72h。黑曲霉菌种保藏培养基为(单位％(w/v))单宁酸0.5％，蛋白胨0.1％，K2HPO40.1％，NaH2PO40.1％，MgSO4·7H2O 0.05％，琼脂6％。黑曲霉发酵培养基为(单位％(w/v))单宁酸1.0％，可溶性淀粉0.2％，蔗糖0.8％，葡萄糖0.3％，豆饼粉0.8％，NH4NO30.1％，K2HPO40.1％，KCl 0.05％，MgSO4·7H2O 0.05％，CaCl20.02％，MnCl2·6H2O 0.04％，FeSO40.001％，pH 6.0。将上述培养72h的菌丝体收集过滤，用0.85％(w/v)NaCl溶液冲洗，在0.01mol/L pH 3本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种微生物法在有机相中合成没食子酸丙酯的方法，其特征在于，方法的步骤如下： １）将黑曲霉孢子培养得到的菌丝体收集过滤，用０．８５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ溶液冲洗，在０．０１～０．２ｍｏｌ／Ｌ ｐＨ２．２～５．８缓冲溶液中平衡后过滤，得到含水量为６０～８０％（ｗ／ｗ）的菌丝体； ２）在有机溶剂苯体系中，每升有机溶剂中加入０．０６～０．１Ｌ的正丙醇和４～１０ｍｍｏｌ的没食子酸，再在每升有机溶剂中加入２０～５０ｇ的上述黑曲霉菌丝体，在搅拌速度１５０～２２０ｒｐｍ和反应温度２０～５０℃下进行生物催化反应，反应时间为４８～９６ｈ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李永泉，喻晓蔚，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。