一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法技术

本发明专利技术提供了一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，该方法使用脂类荧光染料对表面修饰待鉴定的纳米药物载体进行荧光着色，然后添加包被有生物分子的微米级颗粒，最后使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测；该方法简单易操作、反应快速、结果简明有效，可直接证明生物分子是否于纳米药物载体表面修饰成功，填补了这一个在纳米药物技术领域上的空白。

A method for identification of surface modification of nanoscale drug carrier

The present invention provides a method for identification of surface modification of nano drug carriers, the method of using lipid fluorescent dye fluorescence staining on surface modification of nano drug carriers to be identified, and then add the coated with micron sized particles of biological molecules, and fluorescence imaging or fluorescent quantitative detection instruments and equipment; the method is simple and easy to operate. Quick response, simple and effective results, can be directly proved the success of biological molecules in nano drug carrier surface modification, fill this one in the field of nanotechnology drug on the blank.

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法
本专利技术属于生物医学的领域，尤其涉及一种可直接鉴定纳米药物载体的表面修饰情况的方法。
技术介绍
随着纳米技术的飞速发展，纳米药物或纳米药物载体在生物学和医学等方面的应用获得了广泛的关注和重视，为了达到提高纳米药物或纳米药物载体的水溶性、生物相容性、血液循环系统存留时间、靶向性及治疗效果和降低其毒副作用等目的，通常会使用抗体、受体、配体、脂类分子、糖类分子或是核酸分子等特异性的生物分子对纳米药物或纳米药物载体进行修饰。血清脂蛋白是人体或动物体血液中天然存在的运送脂类等物质的载体，其包括乳糜微粒(CM)、极低密度脂蛋白(VLDL)、中间密度脂蛋白(IDL)、低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)等。由于血清脂蛋白优良的生物相容性以及内部疏水、外部亲水等特性，重组血清脂蛋白被用作药物载体的研究近年来得到广泛关注和重视，其已成为了纳米药物载体研究的热点之一，重组血清脂蛋白中最主要的是人重组低密度脂蛋白(rLDL)和人重组高密度脂蛋白(rHDL)药物载体。这些重组血清脂蛋白药物载体通常使用磷脂酰胆碱、胆固醇、酯化的胆固醇和脂酰甘油等脂类分子来构建，并在外表面修饰上特异性的载脂蛋白分子或其他分子以提高其在血液内的存留时间、靶向性和药效等。天然存在的血清脂蛋白通常只有十几或几十纳米，而重组血清脂蛋白药物载体的尺寸一般也小于200nm。由于其纳米级的尺寸，重组血清脂蛋白药物载体很难被光学显微镜检测，其本身可以使用透射电子显微镜或动态光散射仪等设备或方法进行形貌和尺寸等的鉴定，但对于修饰到其表面的特异性生物分子，通常没有简单有效的直接检测的方法，只能通过其是否能被细胞识别或其与修饰前相比是否具有改善的性质和药效来进行间接的证明，以往的相关文献中也没有提供直接证据及结论可证明特异性生物分子是否已成功修饰于纳米药物载体表面上。
技术实现思路
本专利技术为解决上述的技术问题，提供一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，这种可以直接鉴定纳米药物载体的表面修饰过程是否成功，并且操作简单，易实现，整个流程耗时短，结果清晰。本专利技术的技术方案：(1)将包被有第一生物分子的微米级颗粒与藕联第二生物分子的纳米药物载体表面修饰分子的抗体或配体的复合物共孵育，使抗体或配体的复合物结合到微米级颗粒表面；(2)将孵育后的复合物-微米级颗粒体系低速离心，去除未结合的所述抗体或配体的复合物；(3)将结合有所述抗体或配体的复合物的微米级颗粒与所述纳米药物载体共孵育，通过抗原-抗体或配体-受体的相互作用，使纳米药物载体结合到微米级颗粒表面，制得悬液；(4)将所述悬液与脂类荧光染料溶液共孵育，使悬液内结合物与脂类荧光染料分子充分结合；(5)将悬液与脂类荧光染料孵育后的混合液低速离心并清洗，去除多余的脂类荧光染料和未结合的纳米药物载体；(6)使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。若微米级颗粒有荧光，表明纳米药物载体表面修饰有需要鉴定的分子；反之，若微米级颗粒没有荧光，表明纳米药物载体表面没有修饰需要鉴定的分子。实验过程中，还设置了2个对照组，分别是未修饰待鉴定分子的纳米药物载体和单一的包被有第一生物分子的微米级颗粒。若需要鉴定纳米药物载体表面修饰的两种或更多种的修饰分子，其鉴定方法和步骤相同，可以先后鉴定不同的分子或设置多个样品组同时鉴定不同的分子。步骤(1)中所述第一生物分子与所述第二生物分子之间可发生生物特异性相互作用。步骤(1)中所述第一生物分子包括链霉亲和素；所述第二生物分子包括生物素。步骤(4)中所述微米级颗粒包括硅珠或磁珠。步骤(4)中所述脂类荧光染料包括尼罗红。步骤(6)中所述仪器设备包括激光共聚焦显微镜或普通荧光显微镜或流式细胞仪。以往的相关研究在重组脂蛋白纳米药物修饰上生物分子后很少去直接鉴定该生物分子是否修饰成功，本专利技术方法提供了一个简单易操作、反应快速、结果简明有效的方法，可直接证明生物分子是否于纳米药物载体表面修饰成功，填补了这一个在纳米药物
上的空白。附图说明图1为本专利技术的原理示意图。图2为荧光共聚焦显微镜检测和鉴定人重组高密度脂蛋白表面修饰的ApoA1和GM1分子的结果示意图：链霉亲和素包被的5μm的硅珠与生物素化的anti-ApoA1(biotin-anti-ApoA1)或生物素化的霍乱毒素B亚基(biotin-CTB)共孵育后，再分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC和磷酸缓冲液共孵育，最后用尼罗红进行荧光染色。I-III为biotin-anti-ApoA1分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC孵育后的荧光成像结果；i-iii为biotin-CTB分别与LT-GM1-rHDL，LT-rHDL，LT-NLC孵育后的荧光成像结果；IV或iv为磷酸缓冲液的结果，其为空白对照组(Ctrl)。图1中1-硅珠，2-生物素化的抗体或配体(biotin-antibody/biotin-ligand)，3-包被在硅珠表面的亲和素(Streptavidin)，4-经脂质荧光染料尼罗红染色的表面修饰有某生物分子的重组脂蛋白药物载体。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式对本专利技术进行进一步说明。实施例1：鉴定LT-GM1-rHDL纳米药物载体的表面修饰ApoA1和GM1：鉴定表面修饰有载脂蛋白ApoA1和神经节苷脂GM1并装载有抗动脉粥样硬化药物洛伐他汀(LT)的人重组高密度脂蛋白(LT-GM1-rHDL)的载脂蛋白ApoA1和神经节苷脂GM1表面修饰是否成功。通过Zeta电位粒度仪检测得到LT-GM1-rHDL纳米药物载体颗粒的平均尺寸约为120nm，透射电镜观察到LT-GM1-rHDL纳米药物载体颗粒为球形，颗粒尺寸与Zeta电位粒度仪测量的尺寸基本相同。将需要鉴定的样品分成A和B两组，A和B两组又各分为4个组，其分别为LT-GM1-rHDL(实验组)、LT-rHDL(第一对照组：有ApoA1无GM1修饰的纳米药物载体)、LT-NLC(第二对照组：无ApoA1无GM1修饰的纳米药物载体)和磷酸缓冲液(空白对照组)，A和B共8组；本实施例所用的包被有链霉亲和素的硅珠的直径约为5μm。(1)取包被有链霉亲和素的硅珠原液，用生物素-亲和素结合缓冲液稀释至浓度约为106个/mL，稀释后充分摇匀。(2)使用1000rpm低速离心硅珠液2min，小心去除上清液后，用100μL磷酸缓冲液重悬硅珠，备用。(3)取8个EP管，分别标记A组和B组，每组各4管，分别加入1mLLT-GM1-rHDL、LT-rHDL、LT-NLC和磷酸缓冲液。(4)A组EP管分别加入5μL200μg/mL生物素化的anti-ApoA1抗体(biotin-anti-ApoA1)；B组EP管分别加入5μL5mg/mL生物素化的霍乱毒素B亚基(biotin-CTB)；两者均在恒温37℃下，120rpm摇床内孵育1h。(5)孵育完成后，向8个EP管中加入100μL备用的硅珠液，充分摇匀在恒温37℃下，120rpm摇床内孵育1h。(6)孵育完成后，继续向8个EP管中分别加入10μg/mL尼罗红荧光染料，在恒温37℃下，120rpm摇床内避光孵育1h，使充分染色。(7)染色完成后，1000rpm低速离心混合液本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，使用脂类荧光染料对表面修饰待鉴定的纳米药物载体进行荧光着色，然后添加包被有生物分子的微米级颗粒，最后使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，使用脂类荧光染料对表面修饰待鉴定的纳米药物载体进行荧光着色，然后添加包被有生物分子的微米级颗粒，最后使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。2.根据权利要求1所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将包被有第一生物分子的微米级颗粒与藕联第二生物分子的所述纳米药物载体表面修饰分子的抗体或配体的复合物共孵育；(2)将孵育后的复合物-微米级颗粒体系低速离心；(3)将复合物-微米级颗粒体系与所述纳米药物载体共孵育，制得悬液；(4)将悬液与脂类荧光染料共孵育；(5)低速离心并清洗悬液与脂类荧光染料孵育后的混合液；(6)使用仪器设备进行荧光成像或荧光定量检测。3.根据权利要求2所述的一种鉴定纳米药物载体表面修饰的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，余川，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西,36