酿酒酵母ＣＧＭＣＣ　Ｎｏ．２２６６及其在制备（Ｓ）－（－）－β－羟基苯丙酸乙酯中的应用制造技术

本发明专利技术提供了一株微生物新菌株酿酒酵母ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．２２６６及其在微生物转化制备（Ｓ）－（－）－β－羟基苯丙酸乙酯中的应用。酿酒酵母ＣＧＭＣＣ　　Ｎｏ．２２６６，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号ＣＧＭＣＣＮｏ．２２６６，保藏日期２００７年１１月２６日。本发明专利技术提供了一株可供生物转化β－羟基苯丙酸乙酯为（Ｓ）－（－）－β－羟基苯丙酸乙酯的新菌株，利用本发明专利技术方法生产的（Ｓ）－（－）－β－羟基苯丙酸乙酯对映体过剩值大于９９．０％，底物摩尔转化率可以达到９２．２％，产品纯度达到９９．８％，硅胶柱层析产物提取收率为９５．６％，固定化细胞颗粒可以重复利用１０次。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一株微生物新菌林酿酒酵母CGMCC No.2266及其在微生物转化制备(s)-(-)-p-羟基苯丙酸乙酯中的应用。(二)
技术介绍
(S)-(-)-(3-i^基苯丙酉吏乙面旨((S)-(-)-Beta-hydroxy-benzenepropanoic acid ethyl ester),分子式为C H1403，分子量194.23。 (S)-(-)-卩-羟基苯丙酸乙 酯是合成(S)-氟西汀的重要中间体。(S)-氟西汀在人体内的作用时间是(R)-氟西汀的3倍。盐酸氟西汀商品名百忧解，是一种选^^性的5-羟色胺再 摄取抑制剂(SSRI),其能有效地抑制神经元从突触间隙中摄取5-羟色胺， 增加间隙中可供实际利用的这种神经递质，从而改善情感状态，治疗抑郁 性精神障碍。适应于各种抑郁性精神障碍、包括轻性或重性抑郁症、双相 情感性精神障碍的抑郁症，心因性抑郁及抑郁性神经症。(S)-(-H3-羟基苯丙酸乙酯的合成途径主要有化学法和生物转化法两 种。在化学催化剂或生物催化剂的作用下，还原(3-羰基苯丙酸乙酯可以 获得(S)-(-)-(3-羟基苯丙酸乙酯。采用化学法不对称还原(3-羰基苯丙酸乙 酯需要在手性催化剂的催化下才能完成，化学还原过程中手性催化剂价格 昂贵、制备过程繁瑣。采用含有羰基还原酶的微生物细胞为生物催化剂不 对称还原P-羰基苯丙酸乙酯具有反应条件温和、立体选择性好、成本低 廉的特点，又被称为手性化合物的绿色合成技术。微生物细胞中含有羰基 还原酶的辅酶NAD(P)H，可以为还原过程提供供氬体，有利于实现辅酶NAD(P)H的原位再生，提高还原反应效率。利用微生物细胞转化技术生 产(S)-(-)-p-羟基苯丙酸乙酯是一种科学、经济、环境友好的合成方法。采用微生物转化法还原p -羰基苯丙酸乙酯制备(s)-(-)-p-羟基苯丙酸乙酯未见专利报道，只有少数公开发表的文章报道如下2005年，巴西科研工作者Joyce Benzaquem Ribeiro等人采用游离的酿 酒酵母(&cc/7<3ro，ces cerevzi/ae )、 汉逊酵母(//<ms*e"w/a s/ .)、 马克思 克鲁纟,酵母(A7w"eram少ces mao:z'(3m^ ) 禾口白i也霉(G^ofn'c/ ww >sp.)在水相中不对称还原p _羰基苯丙酸乙酯制备(s)-(-)-p-羟基苯丙酸乙酯。2006年，德国科研工作者H. Engelking等人采用酿酒酵母)和枯草芽孢杆菌(^"c/〃w"wto7^ )在水相中 不对称还原(3 -羰基苯丙酸乙酯制备(S)-(-)-P-羟基苯丙酸乙酯。上述的研究中共同的特点有两个 一是，均采用游离的细胞进行生物 转化。游离细胞的生物转化过程不利于产物的后续分离才是^^和生物催化剂 的重复利用。二是，均在水相中进行生物转化。由于有机底物(3-羰基苯 丙酸乙酯在水中的溶解度极小，有机底物对细胞也会造成一定的毒害作 用，细胞催化忍受不了大量的底物，因此生物转化生产能力较低。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种可供生物转化p-羰基苯丙酸乙酯为(s)-(-)-卩-羟基苯丙酸乙酯的微生物新菌种酿酒酵母CGMCCNo.2266，以及利用该菌抹生物转化(3-羰基苯丙酸乙酯合成(s)-(-)-P-羟基苯丙酸乙酯的方法。本专利技术采用的技术方案是酿酒酵母CGMCCNo.2266,保藏于中国普通《敖生物菌种保藏管理中心，地址北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号CGMCCNo.2266 ，保藏日期2007年11月26日。菌林来源本专利技术中所述的微生物菌林酿酒酵母CGMCC No.2266是从杭州西湖啤酒厂附近的土壤中筛选得到。将土壤中分离得到的菌抹用于转化卩-羰基苯丙酸乙酯，得到酿酒酵母CGMCC No.2266具有良好的转化卩-羰基苯丙酸乙酯生产(s)-(-)-P-羟基苯丙酸乙酯的能力。所述酿酒酵母CGMCC No.2266的菌落特征在琼脂培养基上呈现出 乳白色、有光泽、平坦、边缘整齐、湿润、表面光滑，质地均匀的菌落形 态。酿酒酵母CGMCC No.2266可应用于微生物转化制备(S)-(-)-P-羟基苯 丙酸乙酯。具体的，所述应用为以p-羰基苯丙酸乙酯为底物，以酿酒酵母 CGMCC No.2266发酵获得的发酵液再制得的固定化细胞颗粒为生物催化 剂，在邻苯二曱酸二丁酯中，于25-35。C转化反应8~72小时，转化液经 分离纯化得到所述(s)-(-)-p-羟基苯丙酸乙酯。所述发酵培养可按常规方法 进行，在常规适用于酿酒酵母的培养基中、常规适用于酿酒酵母发酵的条 件下进行。所述邻苯二曱酸二 丁酯中底物p-羰基苯丙酸乙酯的初始浓度为 5.15~100.0mmol/L。催化剂用量为每L邻苯二曱酸二丁酯中含有的菌体干重相当于以 包埋法将0.330L菌体浓度为3.0 10.0 g/L的发酵液制成固定化细胞颗粒 在液体培养基中增殖培养16 72小时后获得的增殖培养后的固定化细胞 颗粒的菌体干重；所述发酵液中菌体浓度定义为菌体干重与发酵液体积之比。交联法、载体结合法等，其中包埋法最为常用，包埋法的原理是将微生物 细胞截留在水不溶性的凝胶聚合物孔隙的网络空间中，通过聚合作用或通过离子网络形成，或通过沉淀作用，或改变溶剂、温度、pH值使细胞截留、凝胶聚合物的网络可以阻止细胞的泄露，同时能让底物物质渗入进去 和产物扩散出来。作为包埋载体，天然高分子多糖类的海藻酸钠和卡拉胶 应用最多，它们具有固化、成形方便，对微生物毒性小及固定化密度高等 优点。本专利技术中所述固定化细胞颗粒推荐由如下方法制备得到将经酿酒酵 母CGMCC No.2266发酵培养获得的发酵液与等体积1~5% ( w/w% )的 海藻酸钠溶液相混合，所述的发酵液菌体浓度为3.0 10.0 g/L,搅拌均匀 得到混合液，将混合液逐滴滴入浓度为2.5 4.0% (w/w%)的氯化钙溶液 中，连续搅拌，含有菌体的海藻酸钠混合液固化形成凝胶珠固定化颗粒， 将得到的固定化悬浮液放置于35 38。C条件下固化，得到的固定化颗粒用 无菌生理盐水洗涤，获得固定化细胞颗粒，将得到的固定化颗粒分散于发 酵培养基中进行增殖培养16 72 h获得增殖培养后的固定化细胞颗粒，以 增殖培养后的固定化细胞颗粒为生物催化剂。所述固定化细胞颗粒粒径可通过注射器的针头尺寸来控制，推荐为 l~5mm, 最优为2mm左右。在包埋处理过程中，海藻酸钠的浓度推荐为1 5%,最优为2%。推荐按如下方法获得发酵液(1 )斜面培养将酿酒酵母CGMCC No.2266接种至斜面培养基，26 35。C培养4-6天得到斜面菌种；斜面培养基终浓度组成为 麦芽汁5 15g/L,酵母粉2 4g/L,蛋白胨4 6g/L，葡萄糖7~12 g/L，琼脂15 25 g/L,溶剂为水，pH自然；灭菌后冷却制成斜 面；(2) 种子培养将斜面菌种接种至种子培养基，28~32°C、 150~200r/min培养18~28h,得种子液；种子培养基终浓度组成 为葡萄糖26 32g/L,酵母粉2 4g/L,硫酸铵3 6g/L,无水 MgS04 0.2~0.4 g/L, K2HPO4-3H20 0.5~1.5 g/L，本文档来自技高网...

【技术保护点】
酿酒酵母ＣＧＭＣＣＮｏ．２２６６，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：北京市朝阳区大屯路中科院微生物研究所，保藏编号ＣＧＭＣＣＮｏ．２２６６，保藏日期２００７年１１月２６日。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：欧志敏，杨根生，徐姜炎，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]