本发明专利技术公开了一种促进灵芝酸或灵芝多糖生物合成的发酵方法。本发明专利技术对灵芝细胞生长阶段和产物合成阶段所需要的条件进行了考察，依据灵芝细胞生长和产物合成阶段所需环境条件的不一致性，分别考察了ｐＨ两阶段、溶氧两阶段的控制策略对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响，在此基础上，结合中间补料策略，又分别考察了ｐＨ两阶段、溶氧两阶段控制策略或补料策略相互协同在一起后对灵芝酸和灵芝多糖生物合成的影响。试验结果说明，无论是分别采用ｐＨ值两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略或是将ｐＨ两阶段控制策略、溶氧浓度两阶段控制策略与补料策略协同在一起，均显著促进灵芝细胞生长，大幅度提高灵芝酸或灵芝多糖的含量或产量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物细胞培养方法，尤其涉及一种促进灵芝细胞生长、灵芝多糖和灵芝酸生物合成的发酵方法，属于微生物发酵领域。
技术介绍
灵芝(Ganodermalucidum(Leyss ex Fr. )Krast.)属于担子菌纲、多孔菌科、灵芝属高等真菌。传统中医认为，灵芝味甘、性温、无毒，可补心、肝、脾、肺、肾五脏之气，具滋补强身、扶正固本之功效。现代医学研究发现灵芝中所含有效成分主要为灵芝多糖和灵芝酸，灵芝酸和灵芝多糖具有抗癌和抗艾滋病病毒等疗效(Russell R, Paterson M. (2006)Ganoderma-A therapeutic fungal biofactory.Phytochemistry67 :1985-2001 ；Tang ff,Liu Jff, Zhao WM, Wei DZ, Zhong JJ. (2006) Ganoderic acid Tfrom Ganoderma lucidummycelia induces mitochondria mediated apoptosis in lungcancer cells. Life Sci80 :205-211 ；E1-Mekkawy S, Meselhy MR, Nakamura N, Tezuka Y, Hattori M, KakiuchiN, Shimotohno K, Kawahata T, Otake T. (1998)Anti-HIV-I andanti-HIV-l-proteasesubstances from Ganoderma lucidum. Phytochemistry49 :1651-1657)。在灵芝酸和灵芝多糖的药用价值被广泛揭示的同时，灵芝产量和质量成为限制其应用的瓶颈，因为在自然界中野生灵芝十分稀少，且其中灵芝酸含量仅为I毫克/100毫克干重，远不能满足人们的需要；而人工栽培灵芝周期长、产品质量易受环境气候及虫害的影响；因此发酵法生产灵芝酸和灵芝多糖将是一种有效的方法。目前，通过灵芝细胞液体深层发酵所获得的灵芝酸和灵芝多糖的产量仍然较低，李平作等(李平作，徐柔，章克昌.灵芝胞外多糖深层发酵培养基的优化；无锡轻工大学学报1998，17 (4) :26-30)报道了灵芝批培养中培养基的优化方案，但该方法只报道了胞外多糖的生产情况，所公开的最大生物量与胞外多糖的产量分别是14. 8克/升和2. 91克/升(胞外多糖的测定方法为乙醇沉淀-干重法)。日本特许公报(特开平4-304890，5pp)公开了一种灵芝酸的发酵生产工艺，但该专利未涉及灵芝多糖的生产，且所得产物中灵芝酸的含量仅为0. 46-1. 0毫克/100毫克细胞。还有一些专利和文献也公开报道了各种方法，例如，公开号为CN1264743A(专利技术名称液体发酵法同时生产灵芝多糖和灵芝酸的工艺)、CN1375557A(专利技术名称生物反应器中灵芝细胞两阶段培养生产灵芝酸的方法)，授权公告号为CNl 141392C (专利技术名称中间补料发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的方法)等专利文献公开了一系列的通过发酵生产灵芝多糖和灵芝酸的细胞培养方法，但上述这些文献中所公开的细胞培养产物中灵芝多糖或灵芝酸的含量或产量相对较低，尚有待提高。细胞培养的环境条件中，pH和溶氧浓度是灵芝细胞生长和产物合成的关键性影响因子，Fang 等(Fang QH, Zhong JJ. (2002)Effect of initial pH on productionofganoderic acid and polysaccharide by submerged fermentation of Ganodermalucidum. Process Biochem. 37 :769-774.)公开了起始pH值对灵芝细胞液体发酵生产灵芝酸和灵芝多糖的影响，Tang 等(Tang YJ, Zhong JJ, (2003)Role of oxygen supplyin submergedfermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganodermapolysaccharide andganoderic acid. Enzyme Microb. Technol. 32 :478-484.)报道了溶氧浓度对灵芝细胞液体发酵生产灵芝酸和灵芝多糖的影响。上述这些文献中，没有根据灵芝细胞生长和产物合成所需要的环境条件(如pH和溶氧浓度)的不一致性，采用相应的组合控制策略来分别促进芝细胞生长和产物合成，所以其灵芝酸和灵芝多糖的产量或含量还有待提升。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种提高灵芝细胞生长、灵芝酸和灵芝多糖生物合成的灵芝细胞培养方法。本专利技术所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种促进灵芝酸或灵芝多糖生物合成的发酵方法，包括灵芝细胞斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其中，在液体深层发酵时选用以下任何一种方式进行细胞培养(I)PH两阶段将液体发酵液的pH值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的PH值恒定且互不相同；(2)溶氧浓度两阶段将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为25 %，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为10% ;(3)pH两阶段与补料相协同将液体发酵液的PH值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的pH值恒定且互不相同；当培养液残糖浓度在5-10g/L时，每升培养液补加15g乳糖，继续培养；(4)溶氧浓度两阶段与补料相协同将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为25%，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为10% ;当培养液残糖浓度在5-10g/L时，每升培养液补加15g乳糖；(5)pH两阶段与溶氧浓度两阶段相协同将液体发酵液的PH值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的pH值恒定且互不相同；将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为25%，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为10 % ； (6) pH两阶段、溶氧浓度两阶段和补料相协同在一起将液体发酵液的pH值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的PH值恒定且互不相同；将发酵液的溶氧浓度值分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为25 %，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为10% ;当培养液残糖浓度在5-10g/L时，每升培养液补加15g乳糖，继续培养。优选的，所述的pH两阶段是指在细胞培养的前4天将发酵培养体系的pH值控制为3.0 ;自细胞培养的第四天起，将发酵培养体系的pH值控制为4. 5或5.5 ;更优选的，自细胞培养的第四天起，将发酵培养体系的PH值控制为4. 5 ；所述的溶氧浓度两阶段中由第一阶段向第二阶段转换的时间点优选自液体深层发酵的第4天、第6天、第8天或第10天；更优选自液体深层发酵的第6天或第8天。所述的pH两阶段与补料相协同优选为在细胞培养的前四天(第一阶段本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进灵芝酸或灵芝多糖生物合成的发酵方法，包括灵芝细胞斜面菌种培养、一级液体种子培养、二级液体种子培养和液体深层发酵，其特征在于：在液体深层发酵时选用以下六种方法中的任何一种进行细胞培养：（１）ｐＨ两阶段：将液体发酵液的ｐＨ值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的ｐＨ值恒定且互不相同；（２）溶氧浓度两阶段：将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为２５％，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为１０％；（３）ｐＨ两阶段与补料相协同：将液体发酵液的ｐＨ值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的ｐＨ值恒定且互不相同；当培养液残糖浓度在５－１０ｇ／Ｌ时，每升培养液补加１５ｇ乳糖，继续培养；（４）溶氧浓度两阶段与补料相协同：将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为２５％，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为１０％；当培养液残糖浓度在５－１０ｇ／Ｌ时，每升培养液补加１５ｇ乳糖，继续培养；（５）ｐＨ两阶段与溶氧浓度两阶段相协同：将液体发酵液的ｐＨ值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的ｐＨ值恒定且互不相同；将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为２５％，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为１０％；（６）ｐＨ两阶段、溶氧浓度两阶段和补料相协同在一起：将液体发酵液的ｐＨ值分成两个阶段来进行调控，使两个阶段的ｐＨ值恒定且互不相同；将发酵液的溶氧浓度分成两个阶段来进行调控，其中，在液体发酵的第一阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为２５％，在液体发酵的第二阶段将发酵体系的溶氧浓度控制为１０％；当培养液残糖浓度在５－１０ｇ／Ｌ时，每升培养液补加１５ｇ乳糖，继续培养。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：汤亚杰，张伟，
申请(专利权)人：湖北工业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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