本发明专利技术涉及一种采用球形节杆菌生产１７α－去氢甲基睾丸素的方法。该方法是以球形节杆菌（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ Ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ ＡＴＣＣ３１２５０）为菌种、１７α－甲基睾丸素为底物，并采用微生物催化底物Ａ环引入Ｃ↓［１，２］位双键的一种１７α－去氢甲基睾丸素（别名：美雄酮）的生产方法。具体是：用球形节杆菌为菌种，经一级种子培养、二级发酵培养、在菌体发酵液中投入１７α－甲基睾丸素脱氢转化生成１７α－去氢甲基睾丸素。转化完成后，过滤，收集滤饼，可制得１７α－去氢甲基睾丸素。本发明专利技术所涉及的生产方法是以球形节杆菌为生产菌种替代现有方法的简单节杆菌来转化底物，此方法收率高，工艺简单，经济实用，对用生物转化法生产甾体药物有着非常重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物制药及医药工程领域，具体涉及一种采用球形节杆 菌生产17a-去氢甲基睾丸素的方法，该方法是以球形节杆菌为菌种、17oc-甲基睾丸素为底物并采用微生物Cu位脱氢转化生产17a-去氢甲基睾丸素 的方法。17a-去氢甲基睾丸素(Dehydro-17 a-methyltestosterone)即美雄酮 (Methandienone),其化学名为17 a-甲基-17 P -羟基雄甾-1， 4-二烯-3-酮(17 P-hydroxy-17 a-methylandrosta-1， 4-dien-3-one)，结构式如下 图所示，是一种雄性激素及蛋白同化激素，与17a-甲基睾丸素相比具有同 化作用强，雄性样作用小的特点，而且还可作为其它甾体激素的原料中间 体。17a-去氢甲基睾丸素能促进蛋白质合成，抑制蛋白质的异生，维持正 氮平衡，使食欲增进、肌肉增长、体重增加，还可以促使钙、磷在骨组织 中沉积，促进骨细胞间质形成，加速骨钙化和骨生长，同时可促进组织新 生和肉芽形成，加速创伤的修复。临床时适用于慢性消耗性疾病，严重感 染，创伤、烧伤、手术后等的康复，以及纠正应用肾上腺皮质激素引起的 负氮平衡，骨质疏松，小儿发育不良，侏儒症等，并能促进早产儿及未成 熟儿的生长，在治疗骨折不易愈合、高胆固醇血症、产后衰弱等病症时亦 可使用。目前，工业上多采用化学合成的方法生产，收率较低，且对环境及操 作人员都有很大危害；也有采用简单节杆菌(Arthrobacter simplex)为 生产菌株来催化17a-甲基睾丸素d,2位脱氢得到17a-去氢甲基睾丸素的研 究，如中国专利CN 1563409A公开了微生物转化法生产美雄酮的制备方法,
技术介绍
采用简单节杆菌经菌种悬液的制备、 一级种子培养、二级发酵培养、底物转化和产物的分离提取;通过控制培养期和转化期的相关工艺,并采用 GIRARD试剂特异性的分离产物美雄酮和底物17oc-甲基睾丸素。该方法工 艺步骤沉长，引入化学试剂较多，难于保证质量，成本高，投料浓度低， 转化效果差，这限制了大规模工业化生产。因此，研究和开发一种收率高、 工艺简单、经济实用且对环境和操作人员安全的生产方法，对用生物转化 法生产甾体药物有着非常重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种收率高、工艺简 单、经济实用且对环境和操作人员安全的17a-去氢甲基睾丸素的生产方 法。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的一种采用球形节杆菌生产17ot-去氢甲基睾丸素的方法，其生产方法的 步骤是采用球形节杆菌为菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在制成 的菌体发酵液中投入17a-甲基睾丸素进行d,2位脱氢转化，转化完成后， 过滤，收集滤饼，即可制得17a-去氢甲基睾丸素。而且，所述的球形节杆菌由美国典型微生物菌种保藏中心保存，其编 号为ATCC 31250。而且，所述的球形节杆菌的一级种子培养的方式是将球形节杆菌在 琼脂斜面上培养，28 32t:下恒温培养1~2天，3 5"C保藏待用，保藏时间 在15~25天；再将球形节杆菌作为生产菌种从斜面接一满环至种子培养基 中，在旋转式摇床上160~180r/min转速、在30 33。C温度条件下培养18~22 小时，得到适于接种的种子培养液。而且，所述的球形节杆菌的二级发酵培养的方式是将种子培养液按 3~6%体积比的接种量接入到发酵培养基中，在发酵过程中控制摇床转速为 160~180r/min，在30 33'C温度条件下培养18 24小时，得到菌体发酵液。而且，所述的在制成的菌体发酵液中投入17oc-甲基睾丸素进行Cu位 脱氢转化的方式是将17a-甲基睾丸素粉碎研细，粒度为14~16m无菌条 件下投入到菌体发酵液中，投料量为5 8g/L，再在菌体发酵液中加入亲水 性有机溶剂3~5%体积比助溶，得到17ot-去氢甲基睾丸素发酵液。而且，d.2位脱氢转化过程中的转化条件是控制摇床转速为 180~200r/min，在30 35。C温度条件下转化40~50小时，转化完成后，通 过高效液相色谱法来测定转化率。而且，所述的斜面培养基配方为葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%,蛋白胨 1%， MgS(V7H20 0. 2%，调pH值为6. 8~7. 0，加琼脂粉2%;所述的所述的种，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%， K2HP04 0.05%， KH2P04 0 . 05%， NH4C1 0.05%， MgS04*7H20 0. 3%，初始pH值为6. 8~7. 0。而且，所述的发酵培养基配方同种子培养基，在培养基灭菌前加0.05% 底物作诱导物。而且，所述的亲水性有机溶剂为甲醇、乙醇、二甲基亚砜的其中一种。 本专利技术的优点和积极效果是1. 本专利技术提供的17a-去氢甲基睾丸素的制备方法，以球形节杆菌为菌 种、17a-甲基睾丸素为底物并采用微生物一步d.2位脱氢制备17a-去氢甲 基睾丸素，本方法具有反应专一性好，操作简单，成本低，且产物单一， 易于分离纯化的优点，克服了现有步骤繁琐、使用危险试剂、生产成本高、 分离纯化麻烦的缺点。2. 本专利技术所涉及的生产方法是以球形节杆菌为生产菌株替代简单节杆 菌，收率高，工艺简单，经济实用，能够尽量避免使用各种有害试剂，对 用生物转化法生产甾体药物有着非常重要的意义。附图说明图1为本专利技术生产菌株在生长前期的电镜图。图2为本专利技术菌体培养液中d,2位脱氢转化的高效液相色谱图；其中前 一个峰为产物峰，后一个峰为底物峰。具体实施方式下面结合实施例，对本专利技术进一步说明；下述实施例是说明性的，不 是限定性的，不能以下述实施例来限定本专利技术的保护范围。一、 生产菌种为球形节杆菌(该球形节杆菌由美国典型微生物菌种保 藏中心保存，其编号为ATCC 31250)，将该生产菌株在琼脂斜面上3(TC恒 温培养2天，菌体在斜面上己完全长好，从外观上看呈乳白色，在显微镜 下培养前期菌体形状多为短杆状，至稳定期后期时，细胞呈球状或卵圆状。 4。C保藏待用；其中，制作菌体种子悬液采用的液体为新鲜种子培养液，灭 菌条件为121°C， 20min。二、 生产菌株球形节杆菌 d^rote"er. WoiW/biTW's ATCC 31250) 其斜面培养基(％):葡萄糖0.5%，牛肉膏0.3%，蛋白胨1%， MgS04'7H20 0. 2%，调pH值6. 8~7. 0，加琼脂粉2°/。。三、 种子培养基(％):葡萄糖1%，酵母膏0.5%，蛋白胨0.5%， K2HP04 0. 05%， KH2P04 0. 05%, NH4C1 0. 05%, MgS04'7H20 0. 3%，初始pH值为6. 8~7. 0。四、 发酵培养基(％):同种子培养基，但在培养基灭菌前加入0.05%底物作诱导物。本专利技术中采用的17a-甲基睾丸素原料的分子结构式如式I所示，最终所生产出的17a-去氢甲基睾丸素的分子结构式如式II所示( 其转化的化学反应式为<formula>formula see original document page 7</formula>式i 式n 下面通过具体实施实例进一步描述本专利技术。实施例1:一种17(X-去氢甲基睾丸素的生产本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用球形节杆菌生产１７α－去氢甲基睾丸素的方法，其特征在于：生产方法的步骤是采用球形节杆菌为菌种，经一级种子培养、二级发酵培养，在制成的菌体发酵液中投入１７α－甲基睾丸素进行Ｃ↓［１，２］位脱氢转化，转化完成后，过滤，收集滤饼，即可制得１７α－去氢甲基睾丸素。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：路福平，杜连祥，张艺，王春霞，李玉，毛淑红，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]
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