具有改良的聚羟基链烷酸产生能力的去调节的细菌制造技术

提供具有改良的聚－３－羟基链烷酸（ＰＨＡ）产生特性的突变细菌和产生及使用它们的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及基本产生高水平的聚羟基链烷酸(PHA)生物高聚物的 突变微生物。
技术介绍
许多微生物合成和积聚作为能量存储化合物的羟基链烷酸聚合 物(聚羟基链烷酸，PHA)的能力早已得到公认。该类中最常见的化合 物为聚(D(-)-3-羟基丁酸)(PHB)。然而，有些种类的微生物积聚共聚物， 除羟基丁酸外，该共聚物可包含更长链的羟基链烷酸。兴趣集中于这 些PHAs,因为这些生物高聚物为生物相容的、生物可降解的热塑性 塑料，显示类似于石化基聚合物如聚乙烯和聚丙烯的性质的物理性 质。一种产生PHA的示例性细菌，真养沃特氏菌(『m^Mza ewfrap/za)(也称作真养罗尔斯顿菌(i^f/对Oma ￡1^0/ /^)或真养产碱菌(^/￡^//^"^ew^c^/2M)),适应临界营养素如磷酸和氮的限制在发酵期间积聚PHA。 由细菌两步发酵典型地产生PHA。在第一阶段，在包含允许增殖性生 长的完全供给营养素的培养基中培养细菌。允许细菌繁殖，直到细菌 达到足够的生物量，该生物量通常以每升的干细胞重量来测量。在第 二阶^R，限制至少一种生长所必需的营养素例如氮或石岸的利用度，这 具有限制细胞分裂和诱导PHA产生的作用。当营养限制诱导PHA的积 聚时，直到第二阶段才发生相当量的PHA生成。大多数产生PHA的生物体在非限制生长条件下不产生显著水平 的PHA。例如已报导当在无营养限制的条件下培养时，以干细胞重量 的百分比计，沃特氏菌属(『awferaza)(真养罗尔斯顿菌>[又产生3%的 PHA。 Repaske等，Xpp/￡>m>ow A//cra6z'o/。第32巻第585-591页，1976年。这需要在存在不限制营养素的水平时产生显著水平的PHA的修饰 细菌。专利技术概述本专利技术提供分离的营养素去调节的修饰细菌，该细菌在含允许增 殖性生长的足量营养素的培养基存在下，与未修饰的细菌相比，产生 令人惊讶的量的PHA。这样的细菌在存在不限制重要营养素如氮、磷、 镁、^琉酸盐和钾的水平时，产生显著水平的PHA。本专利技术的新型分离细菌(a)在不限制营养素水平的培养条件下，以 细胞干重计，产生至少10Q/()的聚羟基链烷酸(PHA),和(b)在限制4失4旦 不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少20% 的PHA。本专利技术任选不包括该领域先前已知的分离细菌，所述细菌在 不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生约50%或更多 的PHA，且该细菌在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下， 显示PHA的产生增长至少约10%。示例性细菌选自罗尔斯顿菌(尺a/对ow'a ^ec/e》、产碱杆菌 (^4/ca/z'ge"ej1 、沃特氏菌，c&力、动胶菌(Zoog7oecr，c/es)、 芽胞杆菌(5a"'〃ws 、气单胞菌(Jeramo"os1 ，c/e力、固氮菌(yl20toi)ac^r spec/e力、芽月包才炎菌(C7oWn'(iww s/ ec/e力、i若卡氏菌 (A^cw力"j/ ec/es)、 盐杆菌(Z/a/o6a"en'ww 5^ec/e5")或4叚单』包菌 (i^ewcfomo"^ ^ecz&),或其组合。本专利技术的细菌特别不包括已知在不 限制营养素水平的培养条件下，以细胞千重计，产生超过50。/。的PHA 的细菌，如广泛产碱菌(^4/0 //^恥1 /"fw》和维涅兰德固氮菌 (JzotoZ acfer vz力/朋必)的突变体(在NADH氧化酶中的突变)。以细胞重 量计，广泛产碱菌产生约88.3。/。的PHB (Lee等，尸o/ym. Degracto,o" Sto6 第59巻第387-393页，1998年)，以细胞重量计，维涅兰德固氮菌产 生约94。/。的PHA(Page等，Ca". A^cro&o/.第41巻第106-114页， 1995年)。这些修饰细菌可去除一种营养素的调节如磷酸去调节或氮去调 节，或可去除两种或多种营养素的调节如磷酸去调节和氮去调节。优 选，细菌为营养素去调节的产生PHA的生物体，或被另外改造以包含非天然产生PHA的基因如phaC、 A和/或B的PHA阴性突变抹。示例性细菌为2005年6月1日保藏于美国典型培养物保藏中心 (ATCC)， P.O. Box 1549Manassas, VA20108， USA的那些细菌，保藏 号分别为PTA- 6759和PTA-6760。本专利技术也提供还显示以ATCC保藏号PTA-6759保藏的细菌或以 ATCC保藏号PTA-6760保藏的细菌的所有筌别特征的分离细菌。这些 细菌的示例性实施方案为已保藏的细菌的后代，或保藏的细菌的突变 体，其在不限制营养素水平的培养条件下，与未修饰的生物体相比， 保留已保藏的细菌的鉴别特征，即保留相同或相似的引起PHA产生增 加的突变。此外，本专利技术提供包含本专利技术的分离细菌和培养基的培养物。本 专利技术还提供用本文所述的本专利技术的任一种细菌产生PHA的方法。这样 的产生方法包括在合适的培养基中使细菌生长，以使细菌产生PHA的 步骤。另外的任选的步骤包括收获细菌，和/或从细菌中萃取PHA。或 者，如果PHA被分泌入培养基内，该方法可包括使细菌在合适的培养 基中生长和从培养基中萃取PHA的步骤。只要将足够的营养素供给给生物体以允许生长或产生PHA，可使 用在该领域中所知的任何培养基和培养方法。在一方面，本专利技术因此 提供在不限制必需营养素(即营养素以从不限制到引起增殖性生长停 止的程度这样的浓度存在)的培养基中培养这样的细菌的方法。通过实 例，只要在培养基中的营养素没有限制到将显著削弱增殖性生长的浓 度，培养过程包括将细菌从一个发酵罐转移至另 一个发酵罐(按比例增 加)、以及分批或连续进料。在另 一方面，本专利技术还提供依照两步培养法培养本专利技术的细菌的 方法，在该两步培养法中，细菌在限制一种或多种必需营养素如无机 元素的培养基中经历第二步的培养。本专利技术也提供通过限制细菌未去调节微量元素产生PHA的改良 方法。例如，在充分时期的增殖性生长之后，通过使磷酸去调节的细 菌在含限制水平的除磷之外的元素如镁、硫酸或铁(优选铁)的培养基 中生长，可达到PHA产生的提高。提供产生由C4和中等链长的单体(如大于5个碳的单体单位)组成 的PHA共聚物的方法。示例性共聚物包括含C6、 C7、 C8、 CIO、 C12、 C14、 C16和C18共聚物，如3-羟基己酸酯(HH)(C6)、 3-轻基庚酸酯 (HHp)(C7)和/或3-羟基辛酸酯(HO)(C8),特别为含C4和C6(特别为3-羟 基丁酸酯和3-羟基己酸酯或相应的酸)的共聚物，如羟基丁酸酯与羟基 己酸酯共聚物(04- C6),最特别为80-98 %摩尔范围的04和2-20%摩尔 的C6。在美国专利第6,225,438号中描述了另外的共聚物和合适的培养 基。专利技术详述本专利技术提供分离的、修饰的"营养素去调节"的细菌，该细菌在 含有允许增殖性生长的足量营养素的培养基存在下，与未修饰的细菌 相比，产生令人惊讶量的PHA。这样的修饰细菌可被去除一种营养素 的调节，如磷酸去调节或氮去调节，或可被去除两种或多种营养素的 调节如磷酸去调节和氮去调节本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的营养素去调节的细菌，所述细菌能够（ａ）在不限制营养素水平的培养条件下，以细胞干重计，产生至少１０％的聚羟基链烷酸（ＰＨＡ），和（ｂ）在限制铁但不显著限制其它营养素的培养条件下，以细胞干重计，产生至少２０％的ＰＨＡ，其中所述细菌不包括广泛产碱菌（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ　　ｌａｔｕｓ）和具有ＮＡＤＨ氧化酶突变的维涅兰德固氮菌（Ａｚｏｔｏｂａｃｔｅｒ　　ｖｉｎｌａｎｄｉｉ）突变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：PR格林，RI约翰逊，SA邓，
申请(专利权)人：梅雷迪安公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]